学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

作　者: 王萃瑜
导　师: 胡桂学
学　校: 吉林农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒 S基因片段 原核表达 间接ELISA
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 237次
引　用: 3次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪对本病都易感,但对哺乳仔猪的危害最为严重,以仔猪呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床特征。1周龄以内的哺乳仔猪于开始腹泻后2-4d死亡,致死率高达90%以上,给养猪业造成了严重的经济损失。目前,PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、ELISA和RT-PCR法等。随着分子生物学技术的不断发展,间接ELISA法以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。对PEDV的研究表明,S基因编码的S蛋白是猪流行性腹泻病毒（PEDV）的主要的结构蛋白,是诱导机体产生中和抗体和提供黏膜免疫保护作用主要的结构蛋白。与GenBank上的其它毒株相比较发现S基因具有很高的保守性,所以重组S蛋白可作为理想的检测抗原用于临床PEDV。本试验为使S蛋白在原核细胞中得以表达,针对S基因的保守区设计并合成了一对扩增部分S基因的引物P1,P2,以pMD18-T-PS阳性克隆质粒为模板,扩增出目的片段S1基因,片段大小约为500bp。同时采用不同的载体系统,探索了S基因的表达效果,即将猪流行性腹泻病毒的部分S基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a的Sal I和NotI之间的多克隆位点上,进而构建了重组原核表达质粒pGEX-6p-S1和pET-32a-S1。将重组表达质粒pGEX-6p-S1和pET-32a-S1,分别转化到宿主表达菌BL21（DE3）中,用终浓度为1mmol/L的IPTG对宿主表达菌诱导表达。经SDS-PAGE分析表达产物,结果表明:S1基因在原核表达系统pGEX-6p-1和pET-32a中获得表达,表达的重组蛋白大小约为20KD。本实验选择表达量较高的pET-32a-S1原核表达系统,对其进行包涵体提取纯化,得到纯度达90%以上的重组蛋白。Western blot检测表明,表达的重组蛋白能够被PEDV阳性血清所识别。由此说明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。将构建的含有猪流行性腹泻病毒部分S基因原核表达质粒pET-32a-S1进行诱导表达之后,纯化重组蛋白包涵体,通过Western blot检测纯化后蛋白的反应原性。将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,建立可检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法。利用已建立的ELISA方法对吉林省猪场进行血清学检测,检测100份临床血清样品,检出总阳性率为88%。试验结果表明,建立的间接ELISA方法敏感、特异,可用于临床PEDV血清抗体的检测。这为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础,为建立规模化猪场PEDV感染的快速诊断方法提供了科学依据。

全文目录


中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
第一部分 前言  8-18
  1 猪流行性腹泻病毒的研究进展  8-11
    1.1 病毒的分类及形态特征  8-9
    1.2 病毒的理化特性  9
    1.3 病毒的培养特性  9
    1.4 病毒的基因组结构和复制  9-11
  2 PEDV的编码蛋白及其功能  11-14
    2.1 非结构蛋白及其功能  11
    2.2 结构蛋白及其功能  11-14
  3 PEDV与其它冠状病毒的抗原相关性  14-15
  4 PEDV诊断方法的研究进展  15-16
    4.1 免疫电镜法  15
    4.2 免疫荧光法  15
    4.3 微量血清中和试验  15
    4.4 RT-PCR法  15-16
    4.5 ELISA法  16
  5 PED诊断试剂的研究进展  16-17
  6 本实验的目的和意义  17-18
第二部分 实验内容  18-46
  实验一 猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达  18-36
    1 材料与方法  18-28
      1.1 实验材料  18-21
      1.2 实验方法  21-28
    2 结果  28-33
      2.1 目的基因的PCR扩增产物  28-29
      2.2 原核重组表达质粒的构建  29
      2.3 阳性重组表达质粒的鉴定  29-31
      2.4 SDS-PAGE分析  31-32
      2.5 重组蛋白的纯化结果  32-33
      2.6 Western blot分析  33
    3 讨论  33-36
      3.1 目的基因的序列分析  33
      3.2 表达系统的选择  33-34
      3.3 目的蛋白的纯化  34
      3.4 关于免疫印迹  34
      3.5 目的蛋白的活性  34-36
  实验二 重组质粒间接ELISA检测方法的建立  36-46
    1 材料与方法  36-39
      1.1 实验材料  36-37
      1.2 实验方法  37-39
    2 结果与分析  39-44
      2.1 抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定  39-40
      2.2 酶标二抗工作浓度的确定  40
      2.3 血清及酶标二抗最佳反应时间的确定  40
      2.4 封闭液的确定  40-41
      2.5 包被条件的确定  41
      2.6 显色时间的确定  41
      2.7 间接ELISA阴、阳性血清临界值的确定  41-42
      2.8 特异性实验  42
      2.9 重复性实验  42-43
      2.10 临床血清样品检测  43-44
    3 讨论  44-46
      3.1 ELISA工作条件的确定  44
      3.2 抗原的纯度对ELISA的影响  44
      3.3 临床检测结果  44-46
结论  46-47
参考文献  47-51
缩略语表  51-52
致谢  52-53
个人简介  53

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  6. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  7. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  8. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  9. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  10. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  11. IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用,S852.65
  12. 犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立,S852.65
  13. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  14. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  15. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  16. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  17. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  18. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  19. 华东地区鸭圆环病毒感染流行病学调查及其单克隆抗体的制备,S858.32
  20. 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立及NS、NP蛋白细胞定位研究,S858.28
  21. J亚型禽白血病病毒抗体检测方法的建立及LTR体外启动活性分析,S858.31

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
© 2012 www.xueweilunwen.com