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一株植物乳酸杆菌LABR-X产细菌素的研究

作　者: 孙锋
导　师: 范远景
学　校: 合肥工业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 细菌素诱变筛选培养条件纯化抑菌机理
分类号: TS201.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

细菌素(bacteriocin)是某些细菌产生的抑菌肽或蛋白,这些物质可以杀灭和抑制与之相同或相似生境的其他微生物。虽然许多细菌都能产生细菌素,但乳酸菌产生的细菌素更适合在食品工业中应用。现在只有几种商品化的细菌素,如nisin,nisin作为食品添加剂可以非常有效的抑制许多食品中的腐败菌,并延长其货价期。但由于其不能抑制革兰氏阴性菌和抑菌活性的不稳定限制了它在食品工业与饲料工业中的发展,所以我们要继续大力开发其他乳酸菌细菌素。本文从自然的酸菜发酵液中挑选分离出形态良好的8株菌落菌株进行初筛,通过抑菌实验,选取抑菌最大的菌株作为诱变出发菌株LABR,经微生物常规鉴定方法初步鉴定LABR为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。利用紫外线与硫酸二乙酯对LABR多轮复合诱变筛选出抑菌活性最强的菌株LABR-X,在排除有机酸和过氧化氢的干扰后,离心浓缩后的发酵液对指示菌有强烈的抑制作用。优化菌株LABR-X的培养条件,通过正交实验确定了最佳培养条件:培养温度为37℃,MRS培养基的初始pH值为6,接种量为5%(V/V),装液量为60%。在该培养条件下,LABR-X的生长稳定期为18～26小时。LABR-X发酵液经蛋白酶稳定性实验发现,发酵液中的抑菌物质对胰蛋白酶和蛋白酶K敏感,同时结合水合茚三酮反应和双缩脲反应得到的阳性结果,充分证明LABR-X的发酵液中的抑菌物质含有多肽类物质成分,即乳杆菌素。按照蛋白质物质提取纯化原理,LABR-X发酵产物经硫酸铵盐析法粗提、弱酸性阳离子交换树脂层析纯化、Tricine-SDS-PAGE电泳分离等方法提取精制乳杆菌素,通过透析袋处理得到的抑菌活性最大的乳杆菌素组分分子量约20.1kDa,其效价为nisin的2倍,经氨基酸分析仪检测乳杆菌素中含有13种氨基酸和5种未知寡肽。利用光学显微镜与扫描电镜菌体形态观察、碱性磷酸酶活性测定和β-半乳糖苷酶活性测定等方法,对乳杆菌素抑菌机理进行了初步研究与探讨,实验结果显示乳杆菌素能够破坏指示菌的细胞壁和细胞膜,从而达到抑菌的作用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
致谢  8-15
第一章绪论  15-23
  1.1 细菌素综述  16-22
    1.1.1 细菌素的定义及与抗生素的区别  16-17
    1.1.2 细菌素的分类  17-18
    1.1.3 细菌素的抑菌机理及其自我免疫  18-19
    1.1.4 细菌素的应用前景及安全性  19-22
  1.2 本论文的立题意义和研究目的  22-23
    1.2.1 本论文的立题意义  22
    1.2.2 研究的目的  22-23
第二章乳杆菌素高产菌株的诱变选育  23-34
  2.1 实验材料与仪器  23-24
    2.1.1 实验样品  23
    2.1.2 抑菌活性指示菌  23
    2.1.3 试剂  23
    2.1.4 仪器与设备  23-24
    2.1.5 培养基  24
  2.2 实验方法  24-25
    2.2.1 检测方法  24-25
    2.2.2 指示菌及其浓度的确定  25
  2.3 菌种选育方案设计  25-28
    2.3.1 菌种的分离与初筛  25
    2.3.2 酸性末端产物的排除  25-26
    2.3.3 过氧化氢干扰的排除  26
    2.3.4 类细菌素产生菌的鉴定  26-27
    2.3.5 高产菌株的诱变筛选  27-28
  2.4 结果与分析  28-33
    2.4.1 指示菌浓度的确定  28-29
    2.4.2 类细菌素产生菌的初筛  29
    2.4.3 酸性末端产物的干扰  29
    2.4.4 过氧化氢干扰的排除  29-30
    2.4.5 细菌产生菌的鉴定  30-31
    2.4.6 UV照射的最佳剂量  31-32
    2.4.7 硫酸二乙酯(DES)诱变处理  32
    2.4.8 UV与 DES相结合的多轮复合诱变  32-33
    2.4.9 遗传稳定性  33
  2.5 本章小结  33-34
第三章 LABR-X发酵条件的优化及发酵产物蛋白质性质的研究  34-41
  3.1 材料与仪器  34-35
    3.1.1 实验样品  34
    3.1.2 抑菌指示菌株  34
    3.1.3 试剂  34
    3.1.4 仪器设备  34-35
  3.2 实验方法  35-36
    3.2.1 检测方法  35
    3.2.2 发酵条件的单因素实验  35
    3.2.3 正交实验  35-36
    3.2.4 发酵浓缩液对酶的敏感性  36
    3.2.5 水合茚三酮与双缩脲反应  36
    3.2.6 发酵浓缩液在不同pH值下与不同温度下的抑菌活性  36
    3.2.7 发酵浓缩液的抑菌谱  36
  3.3 结果与讨论  36-40
    3.3.1 单因素实验结果  36-38
    3.3.2 正交实验确定产细菌素的最佳条件  38
    3.3.3 优化后菌种 LAB-X的生长曲线  38-39
    3.3.4 发酵浓缩液的酶敏感性  39
    3.3.5 发酵液上清液的茚三酮与双缩脲反应  39-40
    3.3.6 发酵浓缩液在不同pH值和不同温度下的抑菌活性及其抑菌谱  40
  3.4 本章小结  40-41
第四章乳酸杆菌素的提取纯化  41-51
  4.1 实验材料与仪器  41-42
    4.1.1 发酵菌种  41
    4.1.2 抑菌活性指示菌  41
    4.1.3 试剂  41
    4.1.4 仪器与设备  41-42
  4.2 实验方法  42-44
    4.2.1 抑菌性检测方法  42
    4.2.2 nisin标准曲线  42
    4.2.3 考马斯亮蓝 G-250法标准曲线的制作  42
    4.2.4 硫酸铵盐析法粗提  42
    4.2.5 弱酸性阳离子交换树脂层析  42-43
    4.2.6 Tricine-SDS-PAGE方法测定乳杆菌素的分子量  43-44
  4.3 结果与分析  44-50
    4.3.1 nisin标准曲线和牛血清蛋白标准曲线  44
    4.3.2 饱和硫酸铵沉淀盐析  44-45
    4.3.3 弱酸性阳离子交换层析单因素实验  45-46
    4.3.4 最优条件下的洗脱曲线及其抑菌效果  46-48
    4.3.5 乳杆菌素纯化效果  48
    4.3.6 乳杆菌素分子量的估测  48-49
    4.3.7 乳杆菌素的氨基酸组分分析  49-50
  4.4 本章小结  50-51
第五章乳杆菌素抑菌机理的初步研究  51-58
  5.1 材料与仪器  51
    5.1.1 实验样品  51
    5.1.2 抑菌指示菌株  51
    5.1.3 试剂  51
    5.1.4 仪器  51
  5.2 实验方法  51-53
    5.2.1 光学显微镜与扫描电镜观察抑菌效果  51
    5.2.2 碱性磷酸酶(AKP)活性测定  51-52
    5.2.3 β-半乳糖苷酶活性测定  52-53
  5.3 结果与分析  53-57
    5.3.1 乳杆菌素对大肠杆菌作用的光学显微镜观察  53-54
    5.3.2 乳杆菌素对大肠杆菌的扫描电镜图  54-55
    5.3.3 碱性磷酸酶(AKP)活性与β-半乳糖苷酶活性测定测定  55-57
  5.4 本章小结  57-58
第六章结论与展望  58-60
  6.1 主要结论  58-59
  6.2 展望  59-60
参考文献  60-65
攻读硕士学位期间发表的论文  65

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