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大鼠脊髓全横断后miR-124表达变化及其对培养细胞靶蛋白的影响和作用机制研究

作　者: 杨慧娟
导　师: 王廷华
学　校: 昆明医学院
专　业: 神经生物学
关键词: miR-124 大鼠脊髓全横断 microRNA 陈列分析靶蛋白
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

[目的]调查经microRNA芯片分析确定的大鼠全横断脊髓损伤特异表达的microRNAs,选取其中的miR-124在体外转染细胞,确定miR-124调控的靶蛋白,并检测转染后miR-124对培养细胞的影响并分析其作用机制,从而为脊髓损伤后miR-124的调控机制提供重要依据。[方法]SD大鼠随机分为2组,2只大鼠进行T9脊髓横断全横断作为手术组和2只大鼠为假手术组,取横断下1节段脊髓(T10)和1只假手术组肝脏组织进行microRNA阵列分析,分析结果筛选出大鼠全横断脊髓特异表达的4个microRNAs,选取其中的miR-124,利用生物信息学预测miR-124的靶蛋白并结合本实验室前面蛋白组学利用相同的动物模型筛查出的差异蛋白和文献报道确定4个可能的靶蛋白为本实验研究的内容。后将miR-124体外转染Hela和PC12细胞,将两种细胞均分为3个组,分别为正常细胞组,单纯脂质体转染组和miR-124转染组,实验分别从mRNA和蛋白水平确定表达变化的靶蛋白。使用RT-PCR技术检测转染前后miR-124的靶蛋白mRNA的表达变化,同时使用免疫细胞化学测光密度值和Western blot凝胶成像系统分析检测转染前后靶蛋白的表达变化,结果均采用单因素的方差分析进行统计学处理,从而确定miR-124调控的靶蛋白。同时实验中还检测了miR-124转染前后对培养细胞形态学,数量和活力的影响。[结果]1、microRNA芯片分析筛选出4个SD大鼠全横断脊髓特异表达的microRNAs;2、SD大鼠脊髓全横断后在横断脊髓的下1节段miR-124表达下调;3、利用生物信息学预测miR-124的靶蛋白结合本实验室前面蛋白组学实验结果和文献确定4个可能的靶蛋白为实验内容,分别是吡哆醛(维生素B6)激酶(pyridoxal kinase,PDXK),电压依从性阴离子通道2(voltage-dependent anionchannel 2-VDAC2),RhoGDP解离抑制因子(Rho GDP dissociation inhibitor(GDI)alpha,ARHGDIA),NT-4;4、PDXK在3个分组的PC12和Hela细胞免疫细胞化学染色均呈阳性,但光密度值分析无统计学意义,而Western blot检测到PDXK在PC12细胞和Hela细胞中,蛋白含量在单纯脂质体转染组较正常组减少,miR-124转染组较单纯脂质体转染组,蛋白含量进一步减少;而RT-RCR未检测到3个组之间PDXK mRNA的差异,VDAC2在PC12细胞呈现相同的表达变化;5、PC12细胞转染miR-124细胞数目和活力均减低,而在Hela细胞至转染后72h呈现细胞活力的降低,两种细胞转染前后形态无明显变化。[结论]1、miR-124是大鼠脊髓全横断特异表达microRNA;2、在PC12细胞PDXK和VDAC2是miR-124调控的靶蛋白,而在Hela细胞中PDXK是miR-124调控的靶蛋白,且主要以抑制蛋白翻译的调控方式;而在本实验条件下miR-124可能未直接调控ARHGDIA和NT-4在PC12和Hela细胞中表达;3、PC12细胞转染miR-124后VDAC2的下调是其细胞数目和活力的降低的重要原因。

全文目录

摘要  5-9
  中文摘要  5-7
  英文摘要  7-9
论文  9-90
  引言  9-11
  材料和方法  11-66
  结果  66-79
  讨论  79-85
  结论  85-86
  参考文献  86-90
综述  90-98
攻读学位期间发表文章情况  98
硕士研究生期间发表摘要情况  98-99
致谢  99

大鼠脊髓全横断后miR-124表达变化及其对培养细胞靶蛋白的影响和作用机制研究

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