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目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system,CNS)白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。其确切病因及发病机制目前尚未阐明,较公认的观点认为MS与环境、遗传、感染因素有关。因此通过建立动物模型,探讨MS的发病机制,寻求有效的治疗方案,是我们目前研究的主要方向。越来越多的证据表明,氧化应激在MS的动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的中起重要作用。氧化应激是多种不同疾病发病的根本机制,与许多神经疾病有关。氧化损伤在EAE中非常重要,因为中枢神经系统,尤其是少突胶质细胞,对氧化损伤非常敏感。机体中存在大量的内源性抗氧化系统以对抗氧化应激损伤。血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)就是其中之一。HO-1是一种氧化应激诱导下的热休克蛋白,可以催化血红素分解生成一氧化碳(carbon monoxide,CO)和抗氧化剂胆绿素,后者是多种疾病情况下抗自由基的主要防御机制。HO-1可以被热休克和氧化应激等多种刺激因素诱导,在多种病理条件下发挥其抗自由基的内源性保护机制,如炎症、缺血性发作和多种神经变性疾病。但是,只有很少的研究报道过HO-1在EAE中的表达,而且其在EAE中的作用也不清楚。本实验旨在检测HO-1在EAE中的诱导表达,探讨HO-1/CO系统在EAE发病中的影响。通过抗氧化剂-硫辛酸和血红素氧合酶抑制剂-锡原卟啉对EAE大鼠的干预来观察其对脱髓鞘疾病的治疗作用,同时通过基因芯片技术检测与发病相关的基因。方法:1动物分组:将100只成年健康雌性Wistar大鼠,体重180～200 g,随机分出正常对照组6只,其余用新鲜豚鼠全脊髓匀浆(GPSCH)诱导免疫,待第一次发病后随机选出发病组大鼠6只,其余平均分为EAE组、地塞米松组(DXM组,2 mg·kg-1·d-1)、硫辛酸组(LA组,100mg·kg-1·d-1)、锡原卟啉组(SNPP组,100μmol·kg-1·d-1)。其中EAE和各药物干预组再按病程分为缓解、复发两个亚组,每亚组6只(药物干预组动物无复发者,按预实验中统计的EAE组动物缓解复发平均天数分为干预后7天组和干预后14天组)。2模型制备:将新鲜豚鼠全脊髓制成匀浆,加上完全福氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA),佐剂中所含卡介苗6mg/ml,经过乳化后按0.5 ml/只分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射。药物治疗组于动物发病后(神经功能评分达2分)第一天起给予相应剂量腹腔注射,连续注射7天。3神经功能评分:于免疫诱导当日及免疫后每天对动物的体重变化、精神状态、活动情况进行观察,并对动物进行神经功能评分,采用国际通用的Kono评分标准,分为5分:0分正常;1分动物尾部无力;2分尾部无力+肢体无力;3分肢体轻度麻痹;4分肢体严重麻痹,被动翻身后不能复原;5分濒死状态或死亡。4组织病理学:在动物麻醉状态下,快速取其脊髓中腰膨大处组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片,HE染色,光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况。5免疫组织化学染色:取动物脊髓腰膨大处组织,石蜡包埋,做6μm横截面切片,血清封闭,加HO-1一抗,经二抗、三抗孵育,DAB显色,苏木精复染,脱水透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察HO-1表达情况。6脊髓组织中cGMP的测定:动物麻醉状态下,迅速取脊髓腰膨大处组织研磨匀浆,离心,收集上清液,60℃烤箱中烘干,残渣存放于4℃冰箱中批量测定。采用放射免疫法检测cGMP含量。7血清中MDA、SOD的测定:动物麻醉状态下,快速心脏穿刺取血2-3ml离心分离血清,标本置于-20℃冰箱内批量测定。MDA用硫代巴比妥酸法,SOD用黄嘌呤氧化法测定。8信号转导通路发现者基因芯片检测:取各组大鼠的脊髓腰膨大处新鲜组织,提取RNA,逆转录反应生成cDNA,标记探针,与芯片杂交,加入链亲和素耦联的碱性磷酸酶(AP)及化学发光底物反应。图像采集,数据分析。结果:1动物复发情况观察:EAE组动物复发率66.7%,LA组动物复发率33.3%,DXM组和SNPP组动物均无复发。DXM组、LA组、SNPP组复发率均小于EAE组,有统计学意义(P<0.05)。LA组与DXM组、SNPP组之间无统计学意义(P>0.05)。2动物行为学观察:在动物缓解期(发病后第7天)和复发期(发病后第14天)时神经功能评分比较:(1)缓解期:DXM组、LA组、SNPP组评分均小于EAE组,有统计学意义(P<0.05),DXM组、LA组和SNPP组之间评分比较无统计学意义;(2)复发期:LA组与EAE组评分比较无统计学意义(P>0.05),DXM组和SNPP组动物均无复发。3组织病理学观察:发病后各组大鼠脊髓组织内遍布“袖套样”炎性细胞浸润,以灰白质交界区较多,浸润细胞以淋巴细胞为主,且炎性细胞数目的多少与疾病严重程度相一致,发病期血管“袖套”数最多,缓解期血管“袖套”数减少,细胞浸润减轻,复发期几乎很少见到血管袖套样结构,但炎细胞浸润仍很多,呈弥漫分布。缓解期DXM组、LA组、SNPP组血管袖套数目均明显低于EAE组(P <0.01),但各药物干预组间无统计学意义(P>0.05)。复发期各组间血管袖套数目比较都没有统计学意义(P >0.05)。4脊髓HO-1表达:脊髓切片免疫组化染色结果显示,发病期阳性细胞数目最多,缓解期减少,复发期阳性细胞再次增多,并主要分布在炎性细胞浸润的血管“袖套样”病变处,与病灶分布基本一致。SNPP组与DXM组、LA组、EAE组比较,同病期阳性细胞数减少,有统计学意义(P<0.05)。DXM组、LA组、EAE组三组之间无统计学意义(P>0.05)。5脊髓组织cGMP含量比较:动物发病期cGMP含量增加,EAE组缓解期和复发期无明显下降,而同病期的地塞米松和硫辛酸干预组cGMP含量均下降。6血清中丙二醛(MDA)含量比较:动物发病期MDA含量增加,缓解期减少,复发期再次升高,有统计学意义(P<0.05)。各药物干预组与同病期EAE组比较MDA含量均减少,但无统计学意义(P>0.05)。7血清中超氧化物歧化酶(SOD)含量比较:动物发病期SOD含量增加,缓解期减少均有统计学意义(P<0.05),复发期无明显变化。缓解期:LA组和SNPP组含量与EAE组相比均升高,SNPP组更为显著(P<0.01),DXM组与EAE组比较无明显变化;复发期:DXM组和LA组含量与EAE组相比均升高,SNPP组反而降低。8基因芯片分析结果:筛选出10项基因在比较中随病程变化呈现出发病期表达上调,缓解期表达下调,复发期表达再次上调的趋势,考虑与EAE发病有关。其中8项基因在DXM组中缓解期表达下调后复发期未再次上调,考虑与DXM作用有关;3项基因在LA组中缓解期表达下调后复发期未再次上调,考虑与LA作用有关;5项基因在SNPP组中缓解期表达下调后复发期未再次上调,考虑与SNPP作用有关。结论:1硫辛酸和锡原卟啉均可以促进EAE大鼠的病情缓解,降低动物复发率,尤其锡原卟啉与地塞米松效果相似。2锡原卟啉可以减少EAE大鼠脊髓组织HO-1的表达。3 EAE大鼠血清中MDA、SOD含量,脊髓中cGMP含量,脊髓中HO-1表达均与病情活动性相关,随病程发展呈一定的变化趋势,药物干预对各指标有一定影响。4 EAE大鼠不同发病阶段基因表达有差异,且随病程发展呈一定趋势变化,这些差异基因与多条信号转导通路有关,某些基因表达受药物干预影响,可能与药物作用通路有关。
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