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小麦和番茄血红素加氧酶对过氧化氢、热激的应答及其抗氧化防护作用

作　者: 陈笑玥
导　师: 沈文飚
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 血红素加氧酶过氧化氢热激抗氧化防护小麦番茄
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

在动物中,血红素加氧酶(heme oxygenase, HO; EC 1.14.99.3)/一氧化碳(carbon monoxide, CO)信号通路作为抵抗不同胁迫的重要分子机制,可以在活性氧和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)含量增加的情况下被激活。热激能够在转录和蛋白水平上诱导人、大鼠和小鼠的特定细胞系中的HO-1。因此,HO-1也被命名为HSP32。最近的研究表明,HO/CO信号系统在植物对非生物胁迫的应答中发挥了非常重要的调节作用,但还不清楚植物HO是否能响应过氧化氢和热激信号。作为一种响应生物和非生物刺激的活性氧(reactive oxygen species, ROS)分子,过氧化氢(H2O2)在植物细胞内的作用具有两面性,既可以是破坏细胞和大分子结构的毒性分子,也可以作为信号分子调节胁迫适应性和交叉抗性。本文研究了植物中内源H2O2、氧化胁迫适应性和HO之间的关系。研究发现低浓度H2O2(0.05、0.5和5mM)预处理24小时可以浓度梯度依赖性地缓解随后高浓度H2O2 (150 mM)处理6小时对小麦幼苗叶子造成的氧化损伤,其中0.5 mM为最有效预处理浓度。相反,50 mMH2O2预处理并没有起到任何保护效应。进一步研究发现,0.5 mM H2O2处理引发了内源H2O2含量的双峰应答,即处理所形成的一个快速但较弱的内源H2O2含量迸发(峰Ⅰ),以及在4小时形成的另一个更强的峰(峰Ⅱ)；我们同时发现只有峰Ⅰ与HO活性、HO-1基因表达的增加一致；外源H2O2处理0.25小时还诱导了超氧化物歧化酶(SOD)活性、Mn-SOD和Cu,Zn-SOD转录本的增加,说明这可能是内源H2O2峰Ⅰ的来源；结合酶活性检测、半定量RT-PCR及免疫印迹等手段,进一步的结果表明H2O2的清除剂二甲基硫脲(DMTU)不仅阻断了0.5 mM H2O2处理0.5小时对HO的上调,并且逆转了其对氧化损伤的缓解效应。综上,我们认为由SOD活性增加导致的内源H2O2的产生(峰Ⅰ)是通过提高mRNA以及蛋白表达水平诱导了HO,从而提高了小麦幼苗叶片对氧化胁迫的适应性。此外,本文首次发现,45℃热激不但能在3小时内以时间依赖性的方式引起番茄幼苗脂质过氧化和抑制茎生长,还能上调HO的活性和HO-1蛋白的表达；加入HO-1的活性抑制剂锌原卟啉IX (ZnPPIK)则进一步加剧热激诱导的氧化胁迫。为了探究HO在热胁迫下的抗氧化机制,本文进一步检测了ZnPPIX对热激过程中抗氧化酶过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性和相应转录本以及热激蛋白LeHSP17.7、LeHSP20、LeHSP70和LeHSP101转录本的影响。结果发现,当ZnPPIX部分阻遏了热诱导的HO活性上调时,热激过程中两种抗氧化酶的活性明显也受到抑制；类似的,LeHSP70基因表达的上调被显著削弱,LeHSP20基因表达的热诱导被延迟,但LeHSP17.7、LeHSP101.CAT和APX的转录本则不被ZnPPIX影响。以上的研究结果表明,番茄HO能够响应热激,并可能部分参与了热激诱导的抗氧化防护路径。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-10缩略词表 10-12第一章文献综述 12-27 1 植物过氧化氢(H_2O_2)信号的研究进展 12-16 1.1 H_2O_2的产生与清除途径 12-14 1.2 H_2O_2的信号转导 14 1.3 H_2O_2调控的基因表达 14-15 1.4 H_2O_2与交叉抗性 15-16 2 植物响应高温胁迫的反应 16-18 2.1 高温胁迫的发生条件 16-17 2.2 植物对高温胁迫的响应 17-18 3 热激蛋白的研究进展 18-21 3.1 HSP70 18-20 3.2 小分子热激蛋白(smHSPs) 20-21 4 血红素加氧酶的研究进展 21-25 4.1 血红素加氧酶的一级结构 21 4.2 血红素加氧酶的一般生物学功能 21-22 4.3 植物HO/CO的研究进展 22 4.4 血红素加氧酶与热激 22-25 5 本研究开展的目的和意义 25-27第二章内源过氧化氢通过诱导血红素加氧酶提高小麦幼苗叶片氧化胁迫适应性 27-39 1 材料与方法 27-30 1.1 材料培养及处理方法 27 1.2 试剂 27 1.3 一氧化碳(CO)饱和溶液处理 27-28 1.4 硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含景测定 28 1.5 H_2O_2含量测定 28 1.6 酶活性检测 28-29 1.7 HO-1的Western-Blot分析 29 1.8 半定量RT-PCR分析 29 1.9 统计分析 29-30 2 结果与分析 30-36 2.1 外源H_2O_2处理对脂质过氧化的缓解具有浓度依赖性 30-31 2.2 外源H_2O_2引发内源H_2O_2的双峰应答 31-32 2.3 外源H_2O_2处理对HO活性和HO-1基因表达的影响 32-33 2.4 DMTU和CO预处理对脂质过氧化的影响 33-34 2.5 DMTU对内源H_2O_2峰Ⅰ所上调的HO活性、HO-1基因和蛋白表达的影响 34-35 2.6 H_2O_2处理对H_2O_2合成酶的效应 35-36 3 讨论 36-39 3.1 内源H_2O_2双峰的形成 37 3.2 H_2O_2峰Ⅰ上调HO 37-38 3.3 H_2O_2峰Ⅰ诱导的HO参与氧化胁迫适应性的形成 38-39第三章番茄幼苗血红素加氧酶对热激的响应及其抗氧化防护作用 39-51 1 材料与方法 39-42 1.1 材料培养 39 1.2 试剂 39 1.3 茎长分析 39 1.4 硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含屠测定 39 1.5 酶活性检测 39-40 1.6 HO-1的Western-Blot分析 40 1.7 半定景RT-PCR分析 40-41 1.8 蛋白和基因的相对表达量分析 41 1.9 统计分析 41-42 2 结果与分析 42-49 2.1 热处理抑制番茄幼苗茎伸长并促进氧化脂质的形成 42-43 2.2 热处理诱导HO活性及HO-1蛋白表达 43-44 2.3 HO-1活性抑制剂ZnPPIX促进热处理对番茄幼苗的氧化损伤 44-45 2.4 ZnPP1X对热处理下番茄热激蛋白基因表达的影响 45-47 2.5 HO-1活性抑制剂ZnPPIX对热处理下CAT、APX活性和基因表达的影响 47-49 3 讨论 49-51 3.1 热激诱导番茄HO活性及HO-1蛋白表达 49 3.2 番茄HO部分参与热激对LeHSP70和LeHSP20的转录调节作用 49-50 3.3 番茄HO部分参与热激诱导的抗氧化防护路径 50-51参考文献 51-58研究生期间发表的研究论文 58-60致谢 60

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