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水稻条纹病毒抗性相关基因在大肠杆菌中的表达

作　者: 吴双
导　师: 张飞云
学　校: 首都师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻条纹病毒 s1基因 原核表达 诱导 Pull-Down
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


水稻条叶枯病是危害水稻的一种主要的虫媒病害(Rice Stripe),它是由水稻条纹病毒(Rice stripe virus:RSV)引起的。在日本、朝鲜及我国都有过多次反复爆发,带来巨大危害。而水稻的栽培品种中的2个亚种对RSV表现出不同的抵抗性。一个亚种为O.Sativa var.Japonica,品质优良但抗病性差;另一个亚种为O.Sativa var.Indica,品质差但抗病性强。实验发现Indica品种的粗分离物中有高活性的抑制RSV合成的抗性因子,经盐析、疏水及离子交换层析等分离,得到的组分仍然有高的抑制活性。目前已得到一条对RSV有抗性的相关基因,命名为s1。为了研究s1编码蛋白的功能,用大肠杆菌表达载体pET30a+,构建原核表达载体,进行蛋白的原核表达。SDS-PAGE电泳显示:经IPTG诱导,宿主大肠杆菌BL21(DE3)plys表达出了与其分子量大小(32kD)相同的目的蛋白。优化原核表达条件,通过设置时间梯度,发现6小时表达量达到最高;在诱导温度上,我们发现37℃下易形成包涵体,将温度降低到28℃,在不影响表达量的条件下,尽量减少包涵体的产生,最终形成可溶性蛋白。Western-blot进一步证实:目的蛋白得到了正确表达。我们选择Pull-Down的方法初步探索目的蛋白(S1)的作用。以S1蛋白作为“诱饵”蛋白,水稻全蛋白作为“猎物”蛋白,在体外大规模筛选能够和目的蛋白相互作用的水稻蛋白,以推测目的蛋白的具体作用。本论文利用原核表达系统成功地表达出了RSV抗性相关蛋白(S1),并发现水稻中确有蛋白能与目的蛋白结合、相互作用,为后续研究目的蛋白的具体功能打下了基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
第一部分 前言  9-26
  1 水稻条纹病毒的分子生物学  9-12
    1.1 RSV基因组的结构与功能  9-11
    1.2 病毒基因组的复制、转录与表达调控  11-12
  2 植物抗病毒基因工程研究进展  12-15
    2.1 利用病毒来源的基因获得抗病毒转基因植株的策略  13-14
    2.2 转录后基因沉默与植物病毒抗性  14-15
  3 蛋白质相互作用的研究方法  15-18
    3.1 化学交联法(chemical cross-linking)  16
    3.2 免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)  16-17
    3.3 噬菌体展示技术(phage display approach)  17
    3.4 酵母双杂交技术(two hybrid system)  17-18
    3.5 融合蛋白亲和色谱法(protein fusion affinity chromatography)  18
  4 立项依据及实验设计  18-26
    4.1 立项依据  18-25
    4.2 实验设计  25-26
第二部分 材料与方法  26-36
  1 实验材料与试剂  26-30
    1.1 菌株和质粒  26
    1.2 实验试剂的购买  26
    1.3 实验试剂的配制  26-30
  2 克隆载体的构建及检测  30
    2.1 连接反应  30
    2.2 阳性克隆检测及质粒DNA的提取  30
    2.3 DNA序列测定  30
  3 表达载体的构建及目的基因的尝试表达  30-32
    3.1 表达载体pET30a(+)和s1-6的酶切  30-31
    3.2 目的片段和克隆载体的连接及检测  31
    3.3 目的基因在大肠杆菌中的表达  31
    3.4 目的蛋白表达条件的优化  31-32
    3.5 SDS-PAGE电泳检测目的基因的表达水平  32
  4 Western Blotting验证目的蛋白  32-33
    4.1 SDS-PAGE电泳检测  32
    4.2 Western Blotting准备  32-33
    4.3 Semi-dry Blotting  33
    4.4 抗体反应及显色反应  33
  5 蛋白质相互作用探索(Pull-Down)  33-36
    5.1 准备诱饵蛋白  33-34
    5.2 固定诱饵蛋白  34-35
    5.3 准备猎物蛋白  35
    5.4 捕获猎物蛋白  35
    5.5 "诱饵-猎物"洗脱  35
    5.6 SDS一PAGE电泳检测  35-36
第三部分 实验结果与分析  36-43
  1 表达载体的构建及检测  36-38
    1.1 表达载体pET30a(+)的酶切鉴定  36
    1.2 克隆载体s1-6的酶切鉴定  36-37
    1.3 PCR验证目的基因  37-38
  2 s1蛋白的原核表达及表达条件的优化  38-41
    2.1 s1蛋白的原核表达  38-39
    2.2 诱导表达条件的优化  39-41
  3 s1蛋白的原核表达验证  41
  4 Pull-Down体外探索蛋白质相互作用  41-43
第四部分 讨论  43-44
参考文献  44-48
致谢  48

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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