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甲烷氧化菌（Methylosinus trichosporium）OB3b异源蛋白表达系统的初步研究

作　者: 苏涛
导　师: 李信
学　校: 中国农业科学院
专　业: 微生物学
关键词: Methylosinus trichosporium OB3b 异源蛋白表达系统接合转导同源重组绿色荧光蛋白
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Methylosinus trichosporium OB3b是以甲烷为碳源和能源进行代谢的革兰氏阴性细菌,其含有有甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase,MMO),其不仅可以用来生产很多高附加值的化工产品,而且可以用于治理环境中难降解污染物,被认为是一种多功能的生物催化剂。MMO酶活不高,催化氧化过程NADH再生不足等因素限制了其应用,对Methylosinus trichosporium OB3b进行基因工程改造是目前普遍采用的方法,但是这些改造方法缺少在M. trichosproium OB3b中表达异源蛋白的研究。本论文以Methylosinus trichosporium OB3b为材料,探索建立该菌的异源蛋白表达系统,旨在为更好的对甲烷氧化菌进行改造奠定基础。目前对于甲烷氧化菌的基因操作只能依靠接合转导和同源重组来实现,本文通过M. trichosporium OB3b和S17-1(pTJS175)的接合实验,优化了两菌最佳接合细胞密度,结果显示M. trichosporium OB3b的OD540为0.3-0.4,E. coli S17-1的OD600为0.6-0.7为两菌的最佳接合细胞密度。选择pMMO基因簇下游约500bp基因片段做为异源基因的插入位点,以M. trichosporium OB3b染色体DNA为模版,PCR扩增了该区域并构建了含有卡那霉素抗性基因的自杀载体pSHK,酶切验证显示,pSHK通过电转化的方法成功转入E. coli S17-1中,通过卡那霉素筛选E. coli S17-1 (pSHK)和M. trichosporium OB3b的接合子,未得到期望的突变体,无法通过pSHK在该500bp基因区域引入异源基因,推测是由于所设计的pSHK的同源臂太短或该500bp基因为M. trichosporium OB3b生长关键基因所致。选择sMMO基因簇上游约5200bp区域做为异源蛋白基因插入位点,以整合型载体pTJS175为出发质粒,构建了含有绿色荧光蛋白gfp基因的表达质粒pJSG,电转化入S17-1中。通过接合的方法,pJSG成功转入到了M. trichosporium OB3b中,PCR验证结果说明,pJSG通过同源臂Arm1和M. trichosporium OB3b的染色体发生了同源单交换,使整个质粒整合到了M. trichosporium OB3b染色体上的sMMO基因簇上游区域。荧光分析结果显示,整合了pJSG的突变体能够表达gfp基因,进一步通过不同Cu2+浓度的条件下培养结果表明,突变体GFP的表达受PmmoX(mmoX启动子)调控,不添加Cu2+时,可以检测到荧光,当添加Cu2+浓度为10μM时,检测不到荧光。通过以上研究在M. trichosporium OB3b中初步建立了异源蛋白表达系统,为该菌的基因工程改造和异源蛋白表达研究提供了技术支撑。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-22
  1.1 引言  12
  1.2 甲烷氧化菌及其分类  12-14
  1.3 甲烷单加氧酶基因及其蛋白结构  14-16
  1.4 甲烷氧化菌 MMO 的调控机制  16-18
  1.5 甲烷氧化菌基因工程研究进展  18-19
  1.6 甲烷氧化菌工业应用研究进展  19-20
    1.6.1 甲烷氧化菌氧化甲烷生产甲醇的研究  19
    1.6.2 甲烷氧化菌氧化丙烯生产环氧丙烷的研究  19-20
    1.6.3 甲烷氧化菌应用于环境治理的研究  20
  1.7 本论文研究的目的、意义、内容及技术路线  20-22
第二章接合转导实验最佳细胞密度的优化  22-30
  2.1 引言  22
  2.2 材料和方法  22-28
    2.2.1 菌株  22
    2.2.2 质粒  22-23
    2.2.3 E.coli S17-1 的培养方法  23
    2.2.4 M. trichosporium OB3b 的培养方法  23-24
    2.2.5 E. coli S17-1（pTJS175）和 M. trichosporium OB3b 接合作用原理  24-25
    2.2.6 E. coli S17-1（pTJS175）和 M. trichosporium OB3b 接合条件优化的方法  25-26
    2.2.7 不同生长状态E. coli S17-1（pTJS175）的控制方法  26
    2.2.8 不同生长状态M. trichosporium OB3b 的控制方法  26-27
    2.2.9 突变体的验证方法  27
    2.2.10 接合实验条件的评价方法  27-28
  2.3 结果与分析  28-29
    2.3.1 接合实验中 E. coli S17-1(pTJS175)最佳细胞密度的优化  28-29
    2.3.2 接合实验中 M. trichosporium OB3b 最佳细胞密度的优化  29
  2.4 小结  29-30
第三章含有抗生素标记基因突变体的构建  30-42
  3.1 引言  30
  3.2 材料和方法  30-36
    3.2.1 菌株和质粒  30
    3.2.2 菌株的培养方法  30-32
    3.2.3 质粒构建与转化的方法  32-33
    3.2.4 pSHK 质粒的构建策略  33-35
    3.2.5 E. coli S17-1（pSHK/pTJS175)与 M. trichosporium OB3b(甲烷培养)接合的方法  35
    3.2.6 E. coli S17-1（pSHK/pTJS175)与 M. trichosporium OB3b(甲醇培养)接合的方法  35-36
    3.2.7 自杀载体pSHK 与M. trichosporium OB3b 染色体发生同源交换的原理及其突变体的验证方法  36
  3.3 结果与分析  36-41
    3.3.1 pMMO 下游基因和卡那霉素抗性基因的克隆及序列测定  36-38
    3.3.2 自杀载体pSHK 的酶切验证，转化及鉴定  38-39
    3.3.3 转pSHK 的 M. trichosporium OB3b 突变体的筛选  39-41
  3.4 小结  41-42
第四章异源蛋白表达系统的构建  42-58
  4.1 引言  42
  4.2 材料和方法  42-49
    4.2.1 菌株和质粒  42
    4.2.2 菌株的培养方法  42-44
    4.2.3 质粒构建与转化的方法  44-45
    4.2.4 pJSG 质粒的构建策略  45
    4.2.5 E. coli S17-1（pJSG）与M. trichosporium OB3b接合的方法  45-46
    4.2.6 突变体的验证方法  46
    4.2.7 整合型载体pJSG 在 M. trichosporium OB3b 染色体中整合位点的分析方法  46-48
    4.2.8 Colorimetric assary 测定sMMO 酶活  48
    4.2.9 荧光检测方法  48-49
  4.3 结果与分析  49-58
    4.3.1 质粒pJSG 的验证，转化及鉴定  49-50
    4.3.2 pJSG 导入 M. trichosporium OB3b 及其突变体的筛选，鉴定  50-53
    4.3.3 pJSG 在M. trichosporium OB3b 染色体中整合位点的分析  53
    4.3.4 M. trichosporium OB3b 突变体的sMMO 酶活检测  53
    4.3.5 M. trichosporium OB3b 突变体的荧光分析  53-54
    4.3.6 铜离子对M. trichosporium OB3b 突变体表达GFP 的影响  54-56
    4.3.7 本章小结  56-58
第五章结论  58-59
参考文献  59-65
附录主要实验仪器及试剂  65-67
  一、实验仪器  65-66
  二、化学试剂  66
  三、基因操作酶和试剂盒  66-67
致谢  67-68
作者简历  68

甲烷氧化菌（Methylosinus trichosporium）OB3b异源蛋白表达系统的初步研究

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