学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

铜抗性全细胞传感器的构建和表达

作　者: 李艳
导　师: 侯占铭
学　校: 内蒙古师范大学
专　业: 植物学
关键词: 铜全细胞传感器报告基因绿色荧光蛋白 Cop A
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 42次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

利用聚合酶列式反应(PCR)从大肠杆菌中扩增到类铜的特异性启动子Cop A和铜调控蛋白CueR基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,pGEM为载体,构建成离子诱导表达质粒CGPNPCT,转化入大肠杆菌DH5a宿主菌体中,加入铜离子诱导表达,测定其对重金属铜及其衍生物的耐受性。成功制备了抗重金属铜的工程菌株,研究了工程菌株的荧光强度与铜离子浓度和诱导时间的关系,以及工程菌的性质,以考察工程菌株用于快速检测重金属铜的可行性。工程菌株的研究结果如下：1.以含CGPNPCT质粒的DH5α在无铜诱导时绿色荧光蛋白的表达量为对照,加入Cu2+诱导4h后,测定表达荧光的吸收光谱,可见在480-520nm有吸收峰。2.工程菌DH5α(CGPNPCT)在培养基中加入不同终浓度的Cu2+诱导4h发现,随着铜离子(Cu2+)浓度的增加,诱导的荧光表达量逐渐上升,铜离子在1.5mmol/L时达到最高值,然后下降,3mmol/L达到平衡,在0～4mmol/L范围内,荧光强度和离子浓度呈正相关。3.工程菌DH5α(CGPNPCT)在培养基中加入不同浓度的Cu2+做诱导,在0-12个小时的时间段内每两个小时取样测定荧光值,数据显示,荧光值随Cu2+浓度增大呈明显上升趋势。铜离子(Cu2+)浓度相同时,随着时间梯度的变化,荧光值稳定上升,与时间呈正比。4.分别采用6种重金属离子(Cu2+、As5+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Pb2+)对工程菌株进行诱导,测定荧光强度考察工程菌株对铜离子的特异性。发现,工程菌株对铜以外的重金属离子基本没有响应,说明工程菌株对铜离子具有较强的特异性。上述结果表明,以绿色荧光蛋白基因为报告基因的工程菌株DH5α(CGPNPCT)有望建立起一种方便快捷的重金属铜的检测方法—微生物全细胞传感器法,具有很高的应用价值。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
第一章文献综述  13-35
  引言  13-14
  1 微生物全细胞传感器概述  14-16
  2 微生物全细胞传感器的种类  16-18
    2.1 非特异性微生物细胞传感器  16-17
    2.2 半特异性微生物细胞传感器  17-18
    2.3 特异性微生物细胞传感器  18
  3 用于构建微生物全细胞传感器的报告基因  18-26
    3.1 构建微生物全细胞传感器的报告基因满足的条件  18-19
    3.2 通常使用的报道基因的比较  19-26
      3.2.1 氯霉素乙酰基转移酶  19-20
      3.2.2 β-半乳糖苷酶  20-21
      3.2.3 萤火虫荧光素酶  21-22
      3.2.4 细菌荧光素酶  22-23
      3.2.5 碱性磷酸酶  23
      3.2.6 荧光蛋白家族  23-26
        3.2.6.1 绿色荧光蛋白(GFP)简介  24
        3.2.6.2 GFP的理化性质、荧光特性  24-26
          3.2.6.2.1 GFP的理化性质  24-25
          3.2.6.2.2 GFP的荧光原理  25
          3.2.6.2.3 GFP的荧光性质及应用广泛的优点  25-26
  4 基因表达和调控  26-31
    4.1 基因的结构  26-28
    4.2 启动子的概述  28-29
      4.2.1 原核生物启动子的结构  28-29
      4.2.2 真核生物启动子的结构  29
    4.3 基因表达与调控  29-30
    4.4 调控报告基因表达的机制  30-31
  5 本项目的立题背景、研究内容和意义  31-35
    5.1 立题背景  31-32
    5.2 研究技术路线  32-33
    5.3 研究内容  33-34
    5.4 研究意义  34-35
第二章以gfp为报告基因的铜抗性全细胞传感器的基础构建  35-62
  1 前言  35-36
  2 实验材料、试剂与仪器  36-44
    2.1 实验材料  36-39
      2.1.1 菌种及质粒  36
      2.1.2 实验溶液的配制  36-37
      2.1.3 培养基与抗生素浓度  37-38
      2.1.4 聚合酶链式反应技术(PCR)的引物合成  38-39
      2.1.5 融合PCR和扩增PCR的反应条件  39
    2.2 试剂及其操作步骤  39-44
      2.2.1 E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit  39-40
      2.2.2 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit  40-42
      2.2.3 E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit  42-43
      2.2.4 琼脂糖凝胶电泳  43
      2.2.5 实验用到的酶制剂  43
      2.2.6 荧光检测  43-44
    2.3 仪器设备  44
  3 实验方法  44-58
    3.1 GPF基础细胞传感器的构建  44-58
      3.1.1 pGEM-luc-CGP重组型质粒的构建  47-52
        3.1.1.1 CopA启动子和GFP的PCR的扩增  47-48
        3.1.1.2 CopA和GFP融合PCR的扩增  48-49
        3.1.1.3 pGEM载体的制备  49-50
        3.1.1.4 pGEM载体与CopA-GFP的连接转化  50-52
      3.1.2 pGEM-CGP-NptⅡ重组型质粒的构建  52-54
        3.1.2.1 NptⅡ的PCR扩增  52-53
        3.1.2.2 pGEM-CGP载体的制备  53
        3.1.2.3 pGEM-CGP载体和NptⅡ的连接转化  53-54
      3.1.3 调控蛋白Cue和Terminator终止子的连接  54-56
        3.1.3.1 特异性调控蛋白Cue R-PCR扩增  54-55
        3.1.3.2 Terminator终止子PCR扩增  55
        3.1.3.3 调控蛋白Cue和Terminator终止子的融合  55-56
      3.1.4 pGEM-CGP-NptⅡ载体和目的片段Cue-Te的连接转化  56-58
  4 实验结果  58-61
    4.1 pGEM-CGP-NptⅡ-Cue-Te构建的电泳结果  59-60
    4.2 pGEM-CGP-NptⅡ-Cue-Te构建的酶切结果  60-61
  5 小结  61-62
第三章铜抗性全细胞传感器CGPNPCT的表达情况  62-72
  1 前言  62
  2 材料、主要试剂和器材  62-63
    2.1 实验材料  62
    2.2 实验主要试剂  62-63
    2.3 实验器材  63
  3 实验方法  63-66
    3.1 全细胞传感器的表达验证  63-64
      3.1.1 pGEM-CGP-NptⅡ-Cue-Te全细胞传感器的表达验证  63-64
      3.1.2 工程菌株pGEM-CGP-NptⅡ-Cue-Te的遗传稳定性  64
    3.2 铜抗性全细胞传感器的耐受性检测  64
    3.3 铜抗性全细胞传感器特异性的测定  64-65
    3.4 底物浓度单因素对荧光表达强度的影响  65
    3.5 诱导时间单因素对荧光表达强度影响  65
    3.6 浓度与诱导时间双因素对荧光表达强度的影响  65-66
  4 结果  66-70
    4.1 铜抗性全细胞传感器诱导GFP的表达  66-67
    4.2 浓度因素对荧光表达强度的影响  67-68
    4.3 诱导时间对荧光表达强度的影响  68
    4.4 浓度与诱导时间双因素对荧光表达强度的影响  68-69
    4.5 六种不同重金属对荧光表达强度的比较  69-70
  5 小结  70-72
第四章讨论与展望  72-73
参考文献  73-80
致谢  80-81
附录  81-82

铜抗性全细胞传感器的构建和表达

内容摘要

全文目录

相似论文