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体细胞核移植牛肺脏中印记基因的DNA甲基化状态分析

作　者: 陈洁
导　师: 李世杰
学　校: 河北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 体细胞核移植牛 DNA甲基化 印记基因 H19 Xist Mash2
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目前,体细胞克隆虽然在多种哺乳动物中获得后代,但其效率仍然很低,只有2-5%,而且核移植过程中存在孕期流产率高、围产期死亡率高、新生儿死亡率高及动物出生后发育异常的问题,这严重制约了体细胞核移植技术在医药行业、动物生产及拯救濒危动物等方面的应用。在体细胞克隆中,供体核来自高度分化了的体细胞,在分化过程中,体细胞核获得了高度特异的DNA和组蛋白的表观遗传修饰,而发生在克隆后几小时内供体核的表观遗传修饰重编程,决定了克隆胚胎的发育能力。通常认为,供体核的不完全或异常重编程导致在发育过程中有重要作用的基因异常表达或没有表达是克隆效率低下的主要原因。基因组印记是由等位基因表观遗传修饰的不对称导致的基因表达具有亲本选择性。发生在DNA‘CG’二核苷酸上的甲基化是基因组印记的一个普遍调控方式。大多数印记基因在调控胚胎生长和出生后的发育中起重要作用。H19基因与胚胎形成和胎儿生长的调控有关;Xist基因是一种非编码的RNA,在X染色体失活过程中起着关键性作用;Mash2基因刺激单核滋养层细胞增殖和抑制双核细胞形成。为了探求新生死亡的体细胞核移植牛中印记基因的DNA甲基化表观重编程是否充分,本研究利用亚硫酸氢盐测序法分析了H19、Xist和Mash2三个基因在出生48 h内死亡的克隆牛和正常对照牛肺脏中的DNA甲基化状态。实验结果显示,H19基因在体细胞核移植牛中甲基化程度较低,与正常对照组相比差异显著(P<0.05),并且9C3个体有3个CpG(第1,2,3位)表现出完全非甲基化;正常对照组中甲基化模式种类复杂,克隆组中甲基化模式的整齐度较好。Xist基因甲基化程度在体细胞核移植牛和正常对照牛中都较高,且没有显著差异。Mash2基因的平均甲基化水平在正常对照与体细胞核移植组中分别为20.04±9.99%和5.55±5.36%,组间差异显著(P<0.05),尤其是9C5个体在所检测的28个CpG位点中甲基化百分比为0.4%。上述实验结果表明与生长发育密切相关的印记基因DNA甲基化的不完全重编程在体细胞核移植牛中具有一定的普遍性,DNA的异常甲基化会造成印记基因表达紊乱,从而影响个体器官的正常发育,可能是导致克隆效率低下和克隆动物器官发育异常的主要原因之一。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-21
  1.1 体细胞核移植与表观重编程  10-11
  1.2 DNA 甲基化  11-18
    1.2.1 DNA 甲基化概述  11-13
    1.2.2 DNA 甲基化的功能  13-14
    1.2.3 甲基化的研究方法  14-18
  1.3 体细胞核移植动物中 DNA 甲基化研究  18-19
  1.4 所研究的印记基因  19-20
    1.4.1 H19  19
    1.4.2 Xist  19
    1.4.3 Mash2  19-20
  1.5 研究内容及意义  20-21
2 材料与方法  21-31
  2.1 实验材料  21-23
    2.1.1 牛组织材料  21
    2.1.2 实验用酶  21
    2.1.3 其他药品及试剂  21
    2.1.4 培养基的配制  21
    2.1.5 其他试剂的配制  21-23
    2.1.6 主要仪器和设备  23
  2.2 实验方法  23-31
    2.2.1 牛肺脏基因组 DNA 的提取  23-24
    2.2.2 基因组 DNA 的琼脂糖检测  24
    2.2.3 基因组 DNA 的纯度检测  24
    2.2.4 基因组 DNA 的酶切  24-25
    2.2.5 亚硫酸氢盐处理  25
    2.2.6 CpG 岛预测及 BSP‐PCR 引物设计  25-26
    2.2.7 印记基因的半巢式 PCR 扩增  26-27
    2.2.8 PCR 产物回收  27-28
    2.2.9 PMD18‐T 载体连接反应  28
    2.2.10 感受态细胞的制备  28-29
    2.2.11 连接产物转化大肠杆菌  29
    2.2.12 重组克隆的筛选与鉴定  29
    2.2.13 重组质粒提取和测序  29-30
    2.2.14 数据分析  30-31
3 结果与分析  31-48
  3.1 基因组 DNA 的提取和检测结果  31
  3.2 CPG 岛预测结果及 BSP‐PCR 引物  31-35
    3.2.1 H19 基因 CpG 岛预测及引物设计  31-33
    3.2.2 Xist 基因 CpG 岛预测及引物设计  33-34
    3.2.3 Mash2 基因 CpG 岛预测及引物设计  34-35
  3.3 BSP‐PCR 扩增结果  35-37
    3.3.1 H19 基因 PCR 扩增  35
    3.3.2 Xist 基因 PCR 扩增  35-36
    3.3.3 Mash2 基因 PCR 扩增  36-37
  3.4 纯化回收检测  37-38
  3.5 重组克隆的菌落 PCR 检测  38-39
  3.6 序列测定  39-43
  3.7 印记基因的甲基化状态  43-45
    3.7.1 H19 基因的甲基化状态  43-44
    3.7.2 Xist 基因的甲基化状态  44
    3.7.3 Mash2 基因的甲基化状态  44-45
  3.8 数据分析  45-48
4 讨论  48-50
5 结论  50-51
  5.1 H19 基因的甲基化状态分析  50
  5.2 XIST 基因的甲基化状态分析  50
  5.3 MASH2 基因的甲基化状态分析  50-51
参考文献  51-56
附录  56-57
在读期间发表论文  57-58
作者简介  58-59
致谢  59

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 细胞工程
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