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蚀木链霉菌耐热内切纤维素酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

作　者: 高克学
导　师: 郭润芳
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 耐热内切纤维素酶克隆原核表达目的蛋白定位分析酶学性质
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

纤维素是地球上最丰富的可再生的自然生物资源,而来源于低成本的可再生性纤维素资源的生物制品和生物能源对于人类的可持续发展又是非常重要的,利用纤维素酶的降解作用进行纤维素的生物转化有着广阔的前景。随着基因工程技术的发展,利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中以期得到高比活力的重组型纤维素酶。放线菌可产生较为完整的纤维素酶体系,且很多是耐热的。由于酶的耐热性在生产中具有实用意义,所以耐热菌成为研究的热点。本试验克隆了蚀木链霉菌中的耐热纤维素酶基因,并在大肠杆菌中进行表达,以期得到产生高酶活力重组型纤维素酶的工程菌。根据从国际基因库(GenBank)中下载的多条纤维素酶基因序列设计简并引物,采用PCR方法扩增纤维素酶基因,将回收的基因片段连接到用pMD-18T载体上,进行测序分析。结果表明该全长肽基因读码框大小为1140bp,编码379个氨基酸。对氨基酸序列的在线分析表明,在N端具有信号肽。根据该纤维素酶基因的结构特征和信号肽分析,构建了全长基因和成熟肽的pET-28a重组载体,分别转化到受体菌大肠杆菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下进行表达。表达产物经SDS-PAGE电泳后,分别得到分子量为39 kD和42 kD左右的两条特异表达条带。收集诱导表达的菌体用PBS洗涤后,经反复冻融,采用DNS法对于处于不同位置的表达产物进行酶活力分析。发现含有重组质粒pET-28a/celKX-ns的工程菌所表达出来的蛋白主要是以包涵体形式存在,虽有部分可溶,但酶活性极低。而pET-28a/celKX表达的目的蛋白在破碎后的上清和培养基组分中的酶活都很高,分泌到培养基中的耐热内切纤维素酶占有活性的总酶量的80.3%,真正实现了胞外可溶性和有活性蛋白质高效的表达,优化诱导表达条件后,胞外酶活可达3.211IU/mL。表达产物酶学性质研究表明:表达产物反应的最适温度分别为55℃,最适pH分别为5.5。表达产物具有很好的热稳定性和pH稳定性。结果初步表明,重组的大肠杆菌产生的耐热中性内切纤维素酶为中性纤维素酶,具有较高的酶活力,在纺织工业潜在的应用价值。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-20
  1.1 纤维素概述  9-10
    1.1.1 纤维素的结构及构成  9
    1.1.2 纤维素的降解  9-10
  1.2 纤维素酶的研究进展  10-19
    1.2.1 纤维素酶的组成  10-11
    1.2.2 纤维素酶的分子结构  11-12
    1.2.3 纤维素酶的作用机理  12-14
    1.2.4 纤维素酶的来源  14-16
    1.2.5 纤维素酶的分子生物学研究进展  16-17
    1.2.6 纤维素酶的应用  17-19
    1.2.7 纤维素酶工业中存在的问题和研究趋势  19
  1.3 本课题研究的意义和内容  19-20
2 材料与方法  20-30
  2.1 试验材料  20-22
    2.1.1 菌株与质粒  20
    2.1.2 酶及生化试剂  20
    2.1.3 培养基及有关的溶液配制  20-21
    2.1.4 主要设备  21-22
  2.2 试验方法  22-30
    2.2.1 蚀木链霉菌KX6 全基因组DNA 的提取  22
    2.2.2 引物的设计与合成  22-23
    2.2.3 反应条件和反应体系  23
    2.2.4 扩增产物的回收  23-24
    2.2.5 克隆质粒的构建  24
    2.2.6 感受态细胞的制备  24
    2.2.7 克隆质粒的转化  24-25
    2.2.8 SDS 碱裂解法小量制备质粒DNA  25
    2.2.9 阳性克隆的筛选与鉴定  25
    2.2.10 纤维素酶基因的测序与分析  25-26
    2.2.11 原核重组表达载体的构建  26
    2.2.12 重组蛋白诱导表达  26
    2.2.13 重组工程菌表达产物的SDS-PAGE 分析  26
    2.2.14 目的蛋白分析  26-28
    2.2.15 重组工程菌表达产物的酶活力检测  28
    2.2.16 影响纤维素酶异源表达因素的研究  28
    2.2.17 重组工程菌的稳定性检测  28
    2.2.18 重组工程菌在发酵罐中的培养  28-29
    2.2.19 酶学性质  29-30
3 结果与分析  30-45
  3.1 纤维素酶基因celKX 的克隆及序列分析  30-34
    3.1.1 纤维素酶基因celKX 的克隆  30
    3.1.2 克隆质粒的酶切验证  30-31
    3.1.3 纤维素酶基因的序列分析  31-32
    3.1.4 同源性比较  32-34
  3.2 cel 基因在大肠杆菌中的分泌表达  34-39
    3.2.1 分泌型重组质粒的构建  34-35
    3.2.2 诱导表达筛选  35-36
    3.2.3 表达产物的SDS-PAGE 分析  36-37
    3.2.4 目的蛋白的定位进行分析  37-38
    3.2.5 表达产物的酶活性分析  38-39
  3.3 基因工程菌株的筛选  39
  3.4 影响重组菌发酵的因素  39-40
  3.5 转化子遗传稳定性试验  40-41
  3.6 重组蛋白的酶学性质研究  41-45
    3.6.1 最适反应温度  41-42
    3.6.2 最适反应pH  42
    3.6.3 热稳定性  42-43
    3.6.4 pH 稳定性  43
    3.6.5 影响酶活力的因子  43-45
4 讨论  45-48
  4.1 影响耐热纤维素酶的异源分泌表达的因素  45-47
    4.1.1 异源表达系统的选择  45-46
    4.1.2 信号肽选择  46
    4.1.3 其它因素  46-47
  4.2 酶学性质及其应用  47-48
5 结论  48-49
6 参考文献  49-53
7 在读期间发表的学术论文  53-54
8 作者简介  54-55
9 致谢  55

蚀木链霉菌耐热内切纤维素酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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