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利玛原甲藻中聚酮合成酶基因的克隆与表达分析

作　者: 汤敬谦
导　师: 杨维东
学　校: 暨南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 利玛原甲藻 聚酮合成酶 腹泻性贝毒 基因克隆
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:获得利玛原甲藻(Prorocentrum lima)聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)基因,进行序列分析和同源性比较;观察不同生长期、不同营养盐条件下利玛原甲藻的产毒情况及PKS基因的表达变化,分析PKS基因与藻毒素合成的关系,揭示PKS在腹泻性贝毒(diarrheic shellfish poisoning,DSP)合成中的作用。方法:采用兼并引物,通过PCR技术获得利玛原甲藻可能存在的Ⅰ型PKS基因;并对所获得PKS基因的同源性进行分析,构建基于PKS氨基酸序列的系统进化树;采用RT-PCR技术初步分析PKS基因在利玛原甲藻中的表达状况;并通过多聚腺苷酸RNA的扩增、细菌的分离鉴定、限制性内切酶酶切、Southernblotting等技术对PKS基因进行分析;观察利玛原甲藻不同生长期、不同营养盐条件下DSP毒素的生成情况,采用半定量RT-PCR方法分析相应条件下聚酮合成酶基因的表达状况。结果:克隆得到利玛原甲藻PKS基因,发现该基因在利玛原甲藻中有显著表达。系统进化分析显示,利玛原甲藻PKS基因与海洋原甲藻聚为一支。以Oligo(T)引物进行RT-PCR扩增时,可出现18S rRNA和PKS基因相应条带;限制性内切酶酶切和Southern blotting结果显示,该基因中存在明显的甲基化;16S rRNA基因序列分析显示,从利玛原甲藻培养液中分离到的细菌与海洋放线菌假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)基因序列同源性达到99%,说明该菌株中并不存在PKS基因,表明本文所获得的PKS基因确实来源于利玛原甲藻,基因序列已提交GenBank(EF521601)。不同生长期、不同营养条件下利玛原甲藻中单位细胞OA的含量有所不同,PKS基因的表达也不同。单位细胞OA含量与PKS基因表达量成明显正相关,R~2分别为0.9807和0.9831,提示PKS基因的表达可能在DSP毒素的合成中发挥重要作用。结论:成功获得利玛原甲藻PKS基因,PKS基因的表达与毒素的合成成明显的正相关,表明PKS可能在腹泻性贝毒合成中发挥重要作用。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
第一章 前言  9-18
  1.1 赤潮毒素  9-11
  1.2 赤潮毒素的生物合成机制  11-14
    1.2.1 环境因子对赤潮毒素合成的影响  11
    1.2.2 细菌对甲藻毒素合成的影响  11-13
    1.2.3 赤潮毒素合成相关基因的研究  13-14
  1.3 聚酮类化合物的合成  14-15
  1.4 本论文的目的和意义  15-16
  1.5 论文的创新点  16-18
第二章 PKS基因的克隆及分析  18-50
  2.1 实验材料  18-25
    2.1.1 藻种  18
    2.1.2 主要试剂  18-19
    2.1.3 主要实验仪器  19-20
    2.1.4 培养基的配制  20-23
    2.1.5 其他试剂的配制  23-25
  2.2 实验方法  25-38
    2.2.1 藻的培养  25-26
    2.2.2 PKS基因的扩增、转化和克隆  26-31
    2.2.3 PKS基因序列比对及同源性分析  31
    2.2.4 利玛原甲藻PKS基因的表达分析  31-33
    2.2.5 PKS基因的分析与鉴定  33-38
  2.3 结果与分析  38-47
    2.3.1 利玛原甲藻中PKS基因的克隆  38-42
    2.3.2 PKS基因在利玛原甲藻中的表达  42-43
    2.3.3 PKS基因的分析  43-47
  2.4 讨论  47-50
第三章 利玛原甲藻中PKS基因的表达与DSP毒素的生成分析  50-69
  3.1 实验材料  50
    3.1.1 藻种  50
    3.1.2 主要试剂及培养基的配制  50
    3.1.3 主要实验仪器  50
  3.2 实验方法  50-55
    3.2.1 藻的批量培养、比生长速率的确定  50-51
    3.2.2 藻细胞中DSP毒素的粗提与含量测定  51-52
    3.2.3 N-、P-限制条件下利玛原甲藻中OA含量的测定  52
    3.2.4 藻细胞总RNA的提取  52
    3.2.5 半定量RT-PCR反应的条件  52-54
    3.2.6 不同生长期、不同营养盐条件下PKS基因的表达分析  54-55
    3.2.7 统计方法  55
  3.3 结果与分析  55-65
    3.3.1 利玛原甲藻的生长曲线  55
    3.3.2 不同生长期利玛原甲藻中OA的含量  55-57
    3.3.3 不同营养盐条件下利玛原甲藻的生长曲线  57-58
    3.3.4 不同营养盐条件下利玛原甲藻中OA的含量  58-59
    3.3.5 RNA的提取  59
    3.3.6 半定量RT-PCR反应条件的确定  59-62
    3.3.7 不同生长期利玛原甲藻PKS基因表达量分析  62-64
    3.3.8 不同营养盐条件下利玛原甲藻PKS基因表达量分析  64-65
  3.4 讨论  65-68
  3.5 小结  68-69
参考文献  69-75
附录  75-76
在学期间发表论文清单  76-77
致谢  77

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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