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根癌农杆菌介导的丝状真菌转化及脂肪酶基因表达的研究

作　者: 李俊星
导　师: 潘力
学　校: 华南理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 丝状真菌 根癌农杆菌介导转化 脂肪酶 黑曲霉SH-1
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


丝状真菌被广泛应用于生产重组蛋白正受到越来越多的关注。作为基因工程的受体菌,丝状真菌具有与细菌、酵母不同的独特优点:它们不仅具有很强的蛋白外分泌能力,并且更类似于高等真核生物,能够正确的进行各种翻译后加工。因此,丝状真菌不仅在工业酶制剂生产领域,同时在生物医药、食品安全、生物防治以及生物病理学等领域都有广泛的应用。随着基因工程技术的不断深入发展,越来越多的丝状真菌通过进行遗传转化作为外源蛋白表达宿主应用于工业生产等领域。因此,作为其中最关键的技术——遗传转化其作用显得越来越重要。本研究首先进行了野生型曲霉宿主的筛选标记试验,分别研究了潮霉素B、苯菌灵和吡啶硫胺素等3种药物以及乙酰胺氮源利用培养基对于8株工业上常用的曲霉生长的影响。结果表明,潮霉素B、苯菌灵和吡啶硫胺素对于黑曲霉SH-1野生株和泡盛曲霉CBS115.52野生株生长均具有很好的抑制作用,最佳作用浓度分别为100μg/mL、1.5μg/mL和0.1μg/mL,而对米曲霉IFO4177和寄生曲霉CICC2312等少数曲霉的抑制效果较差。在以乙酰胺为唯一氮源的培养基平板上,黑曲霉和泡盛曲霉等8株菌的生长均十分缓慢,抑制效果亦良好。利用Gateway克隆技术分别构建含有苯菌灵抗性基因和amdS基因的双元表达载体,并通过根癌农杆菌介导转化方法选用黑曲霉SH-1和泡盛曲霉CBS115.52作为宿主菌分别完成以上4种筛选标记基因的遗传转化,结果表明以上标记基因都已转化到黑曲霉和泡盛曲霉基因组中,并由此建立糖化酶工业生产菌野生株黑曲霉SH-1的农杆菌介导转化方法。在此基础上,将重组米黑根毛霉脂肪酶基因转入黑曲霉SH-1中,从DNA和蛋白水平对转化子进行了检测,筛选到稳定遗传的转化子并对其表达的脂肪酶酶活进行了初步发酵优化测定。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章 绪论  10-23
  1.1 丝状真菌表达系统  10-17
    1.1.1 丝状真菌转化方法  10-15
    1.1.2 选择标记  15-16
    1.1.3 表达载体  16-17
  1.2 脂肪酶及其应用  17-21
    1.2.1 脂肪酶的结构与催化性质  17-18
    1.2.2 脂肪酶的应用  18-20
    1.2.3 微生物脂肪酶的研究进展  20-21
  1.3 本课题来源、研究内容和意义  21-23
    1.3.1 课题来源  21
    1.3.2 研究内容  21
    1.3.3 研究意义  21-23
第二章 野生型曲霉宿主的筛选标记研究  23-38
  2.1 引言  23-24
  2.2 实验材料与仪器  24-26
    2.2.1 主要试剂  24
    2.2.2 实验仪器  24
    2.2.3 培养基和菌株  24-26
  2.3 实验方法  26
    2.3.1 潮霉素（hygB）敏感宿主筛选  26
    2.3.2 苯菌灵（Benomyl）敏感宿主筛选  26
    2.3.3 吡啶硫胺素（PT）敏感宿主筛选  26
    2.3.4 乙酰胺敏感宿主筛选  26
  2.4 结果与讨论  26-36
    2.4.1 潮霉素（HygB）抗性宿主的筛选  26-29
    2.4.2 苯菌灵（Benomyl）抗性宿主的筛选  29-31
    2.4.3 吡啶硫胺素（PT）抗性宿主的筛选  31-34
    2.4.4 乙酰胺耐受宿主的筛选  34-36
  2.5 本章小结  36-38
第三章 表达载体构建和农杆菌介导的曲霉遗传转化  38-71
  3.1 引言  38-39
  3.2 实验材料与仪器  39-43
    3.2.1 主要试剂  39
    3.2.2 实验仪器  39-40
    3.2.3 主要培养基  40-42
    3.2.4 菌株和质粒  42-43
  3.3 实验方法  43-52
    3.3.1 农杆菌介导PT 抗性基因的曲霉转化  43-47
    3.3.2 双元表达载体pHGW-Bn 的构建  47-51
    3.3.3 农杆菌介导Bn 抗性基因的曲霉转化  51-52
    3.3.4 双元表达载体pHGW-amdS 的构建及曲霉转化  52
  3.4 结果与讨论  52-70
    3.4.1 泡盛曲霉 CBS115.52 的农杆菌(含 pHGW-PT)介导转化结果  52-55
    3.4.2 黑曲霉SH-1 的农杆菌（含pHGW-PT）介导转化结果  55-57
    3.4.3 表达载体pHGW-Bn 的构建结果  57-61
    3.4.4 农杆菌LBA4404（含pHGW-Bn）介导泡盛曲霉转化结果  61-63
    3.4.5 表达载体pHGW-amdS 的构建结果  63-65
    3.4.6 农杆菌LBA1100（含pHGW-amdS）介导泡盛曲霉转化结果  65-67
    3.4.7 农杆菌LBA1100（含pHGW-amdS）介导黑曲霉转化结果  67-70
  3.5 本章小结  70-71
第四章 农杆菌介导脂肪酶基因的黑曲霉转化及其表达  71-87
  4.1 引言  71
  4.2 实验材料与仪器  71-74
    4.2.1 主要试剂及配方  71-73
    4.2.2 实验仪器  73-74
    4.2.3 菌株和培养基  74
  4.3 实验方法  74-78
    4.3.1 农杆菌介导的黑曲霉转化  74-75
    4.3.2 转化子表观酶活检测  75
    4.3.3 基因组提取  75
    4.3.4 转化子PCR 鉴定  75
    4.3.5 胞外蛋白提取及SDS-PAGE 检测  75-77
    4.3.6 亲和层析  77
    4.3.7 转化子初步发酵优化  77-78
  4.4 结果与讨论  78-86
    4.4.1 农杆菌介导黑曲霉转化结果  78-80
    4.4.2 转化子表观酶活检测结果  80
    4.4.3 PCR 鉴定脂肪酶转化子结果  80-82
    4.4.4 蛋白电泳和亲和层析检测结果  82-84
    4.4.5 脂肪酶活力测定  84-86
  4.5 本章小结  86-87
结论与展望  87-89
参考文献  89-94
攻读硕士学位期间发表的学术论文  94-95
致谢  95-96
附件  96

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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