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根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的研究

作 者: 任楠
导 师: 潘力
学 校: 华南理工大学
专 业: 微生物学
关键词: 丝状真菌 泡盛曲霉 异源蛋白表达 根癌农杆菌介导转化
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


丝状真菌具有良好的蛋白分泌能力,而且能对合成的真核蛋白正确地进行各种翻译后加工包括肽链的剪切和糖基化等,其糖基化修饰模式较酵母更类似于高等真核生物。由于在食品及食品加工中长期应用,许多菌种已被认定是安全的。与哺乳动物和昆虫等高等生物表达系统相比,丝状真菌培养方便、生长迅速、成本较低,表达的外源蛋白可以分泌到培养基中,下游的分离纯化简单。加之丝状真菌遗传转化系统研究的迅速发展,为在丝状真菌中表达外源蛋白奠定了基础。本文以泡盛曲霉为研究对象,拟通过根癌农杆菌介导建立其遗传转化体系。通过分泌蛋白图谱分析和药物敏感性分析,确定了以潮霉素B抗性基因和乙酰胺酶基因amdS作为筛选标记的宿主菌;基于Gateway克隆技术,构建了由高效启动子、终止子和目的基因表达框组成的根癌农杆菌双元载体,筛选标记为潮霉素B抗性基因和乙酰胺酶基因amdS;通过根癌农杆菌介导,将构建的双元载体转化泡盛曲霉,获得了含有目的基因的转化子,经过PCR验证、SDS-PAGE蛋白电泳和Western蛋白杂交证明目的基因已转化进入泡盛曲霉,表明根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化具有可行性,所得转化子遗传稳定性高,适合作为异源蛋白的表达体系。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 绪论  10-17
  1.1 丝状真菌表达系统  10-16
    1.1.1 丝状真菌表达系统的优点  10-11
    1.1.2 丝状真菌转化的特点  11-12
    1.1.3 丝状真菌的转化方法  12-14
    1.1.4 丝状真菌转化的筛选标记  14-15
    1.1.5 丝状真菌的表达载体  15-16
  1.2 课题来源及研究内容  16
    1.2.1 课题来源  16
    1.2.2 研究内容  16
  1.3 本课题研究意义  16-17
第二章 泡盛曲霉宿主菌及其对药物敏感性的筛选  17-28
  2.1 引言  17
  2.2 实验材料  17-20
    2.2.1 主要仪器与设备  17
    2.2.2 主要试剂及配方  17-18
    2.2.3 主要培养基及配方  18-20
    2.2.4 菌种材料及质粒  20
  2.3 实验方法  20-23
    2.3.1 泡盛曲霉宿主菌胞外蛋白谱的比较研究  20
    2.3.2 泡盛曲霉孢子对药物敏感性的研究  20
    2.3.3 泡盛曲霉菌丝对HygB 敏感性的研究  20-21
    2.3.4 不同浓度的HygB 对泡盛曲霉菌丝抑制效果的研究  21-23
    2.3.5 用pTAS10 质粒转化泡盛曲霉  23
  2.4 结果与讨论  23-27
    2.4.1 泡盛曲霉宿主菌胞外蛋白谱的比较研究  23-24
    2.4.2 泡盛曲霉孢子对药物敏感性的研究  24-25
    2.4.3 泡盛曲霉菌丝对潮霉素B 敏感性的研究  25-26
    2.4.4 不同浓度的HygB 对泡盛曲霉菌丝抑制效果的研究  26-27
    2.4.5 用pTAS10 质粒转化泡盛曲霉  27
  2.5 本章小结  27-28
第三章 表达载体的构建  28-58
  3.1 引言  28-29
  3.2 技术路线  29-31
  3.3 实验材料  31-33
    3.3.1 主要仪器与设备  31-32
    3.3.2 主要试剂及配方  32
    3.3.3 主要培养基及配方  32-33
    3.3.4 菌种材料及质粒  33
  3.4 实验方法  33-45
    3.4.1 pHA-RML 质粒的构建  33-38
    3.4.2 pA-RML 质粒的构建  38-39
    3.4.3 pH-haci-质粒的构建  39-45
  3.5 根癌农杆菌的转化  45-46
    3.5.1 根癌农杆菌感受态的制备[45]  45
    3.5.2 冻融法转化根癌农杆菌[46]  45-46
  3.6 结果与讨论  46-57
    3.6.1 pHA-RML 质粒的构建结果  46-48
    3.6.2 pA-RML 的构建结果  48-52
    3.6.3 pH-haci-的构建结果  52-57
  3.7 本章小结  57-58
第四章 根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的研究  58-71
  4.1 引言  58
  4.2 实验材料  58-60
    4.2.1 主要仪器及设备  58
    4.2.2 主要试剂及配方  58-59
    4.2.3 主要培养基及配方  59-60
  4.3 实验方法  60-63
    4.3.1 泡盛曲霉转化子的鉴定  60-62
    4.3.2 根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的遗传稳定性研究  62
    4.3.3 pH-haci-转化泡盛曲霉  62
    4.3.4 pA-RML 转化泡盛曲霉  62
    4.3.5 pHA-RML 转化泡盛曲霉  62-63
  4.4 结果与讨论  63-70
    4.4.1 泡盛曲霉转化子的鉴定  63-64
    4.4.2 根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的遗传稳定性研究  64-65
    4.4.3 pH-haci-转化泡盛曲霉  65
    4.4.4 pA-RML 转化泡盛曲霉  65-66
    4.4.5 pHA-RML 转化泡盛曲霉  66-70
  4.5 本章小结  70-71
结论与展望  71-72
  一、结论  71
  二、展望  71-72
参考文献  72-76
攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果  76-77
致谢  77-78
附件  78

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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