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水稻瘤矮病毒P8和Pns10基因在sf9昆虫细胞中的表达

作　者: 黄美英
导　师: 吴祖建
学　校: 福建农林大学
专　业: 微生物学
关键词: RGDV-P8 RGDV-Pns10 bac-to-bac杆状病毒表达系统 Sf9昆虫细胞
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的：利用bac-to-bac杆状病毒表达系统对RGDV-P8和RGDV-Pns10基因加以表达，得到RGDV-P8和RGDV-Pns10基因的真核表达产物，为RGDV-P8和RGDV-Pns10的功能研究奠定基础。方法：在RGDV-P8和RGDV-Pns10基因组片段的基础上设计引物，扩增得到RGDV-P8和RGDV-Pns10 ORF，将其克隆到供体质粒pFastBacTMHTb中，经PCR、酶切和测序鉴定后，将测序正确的质粒转化DH10Bac菌，经筛选、鉴定后，抽提并获取高纯度的重组穿梭载体Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10。用脂质体介导法将重组穿梭载体Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10转染Sf9昆虫细胞，获得重组病毒，并反复扩增后得到大量表达RGDV-P8和RGDV-Pns10蛋白的重组杆状病毒。用重组的杆状病毒再次感染sf9昆虫细胞得到RGDV-P8和RGDV-Pns10融合蛋白，对融合蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果：1．构建了携带RGDV-P8和RGDV-Pns10基因片段的重组供体质粒pfastbacHTb-RGDV-P8和pfastbacHTb-RGDV-Pns10，经双酶切鉴定和序列分析证实RGDV-P8和RGDV-Pns10基因已正确插入供体质粒的多克隆位点。2．构建了携带RGDV-P8和RGDV-Pns10基因片段的重组穿梭载体Bacmid-RGDV-P8和Bacmid-RGDV-Pns10，经PCR鉴定分析证实RGDV-P8和RGDV-Pns10基因已正确转座插入穿梭载体的转座位点。3．用bac-to-bac系统表达了RGDV-P8和RGDV-Pns10融合蛋白，并经SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定，分子量约为48kD和38kD，与融合蛋白的理论分子量相符。结论：本研究成功地在杆状病毒-昆虫表达系统中表达了RGDV-P8和RGDV-Pns10蛋白，为RGDV-P8和RGDV-Pns10蛋白进一步的功能研究和实际应用奠定了良好的基础。

全文目录


中文摘要  7-8
Abstract  8-9
1 前言  9-21
  1.1 RGDV分布和症状  9
  1.2 传毒介体及传毒特性  9-10
  1.3 水稻瘤矮病的发病规律与防治措施  10-11
    1.3.1 水稻瘤矮病的发病规律  10
    1.3.2 水稻瘤矮病的防治措施  10-11
  1.4 基因组结构与功能  11-17
    1.4.1 RGDV粒体形态与特性  11-13
    1.4.2 基因组结构与功能  13-17
  1.5 杆状病毒表达系统研究概况  17-19
    1.5.1 昆虫杆状病毒表达系统的研究和应用进展  17-18
    1.5.2 杆状病毒表达系统的原理及特点  18-19
  1.6 本研究的目的和意义  19-21
2 材料与方法  21-34
  2.1 实验材料  21-23
    2.1.1 供试病毒  21
    2.1.2 试剂和酶类  21
    2.1.3 载体和菌株  21
    2.1.4 实验仪器  21-23
  2.2 实验方法  23-34
    2.2.1 RGDV双链RNA的抽提与纯化及定量  23
      2.2.1.1 RGDV-dsRNA的提取与纯化  23
      2.2.1.2 dsRNA的定量  23
    2.2.2 P8和PNS10基因的扩增  23-25
      2.2.2.1 引物设计与合成  23-24
      2.2.2.2 cDNA合成  24
      2.2.2.3 PCR扩增  24-25
      2.2.2.4 PCR产物纯化  25
    2.2.3 DNA克隆技术  25-26
      2.2.3.1 目的片段与pMD18-T Vector的连接反应  25-26
      2.2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的简易制备(CaCl_2法)  26
      2.2.3.3 连接反应物对宿主感受态细胞的转化  26
    2.2.4 重组克隆的PCR筛选  26-27
    2.2.5 质粒的少量提纯(碱法)  27-28
      2.2.5.1 碱裂解法小量制备质粒DNA  27
      2.2.5.2 P8和PNS10重组质粒的酶切鉴定  27-28
    2.2.6 重组杆状病毒表达载体的构建  28
      2.2.6.1 供体质粒的构建  28
      2.2.6.2 序列测定  28
    2.2.7 重组杆粒的获得与鉴定  28-30
      2.2.7.1 DH10BAC感受态细胞的制备  28-29
      2.2.7.2 转化  29
      2.2.7.3 阳性重组子RGDV-P8-bacmid和RGDV-P10-bacmid杆粒的抽提  29-30
    2.2.8 昆虫细胞的培养  30-31
      2.2.8.1 Grace’s培养基的配制  30
      2.2.8.2 细胞的复苏和传代  30
      2.2.8.3 sf9细胞的冻存  30
      2.2.8.4 血细胞计数板计数  30-31
      2.2.8.5 sf9细胞的培养  31
    2.2.9 重组BACMID DNA转染SF9细胞及重组病毒的收获  31
    2.2.10 扩毒  31
    2.2.11 重组病毒的PCR鉴定  31
    2.2.12 目的蛋白的表达和表达产物的鉴定  31-34
      2.2.12.1 感染  32
      2.2.12.2 细胞收集  32
      2.2.12.3 细胞裂解  32
      2.2.12.4 蛋白的SDS-PAGE电泳  32
      2.2.12.5 蛋白的western-blot鉴定  32-34
3 结果与分析  34-51
  3.1 RGDV-DSRNA的提取及纯化  34
  3.2 目的基因的克隆  34-37
    3.2.1 基因组P8片段的PCR扩增及克隆  34-36
    3.2.2 基因组PNS10片段的PCR扩增及克隆  36-37
  3.3 重组转座载体的构建  37-39
  3.4 重组转座载体的酶切分析  39
  3.5 序列测定与分析  39-40
  3.6 重组杆状病毒BAC-HTB的鉴定  40-41
  3.7 转移载体杆粒制备  41
  3.8 Sf9昆虫细胞生长曲线测定和培养  41-43
  3.9 正常Sf9细胞形态和Bac-HTb转染后Sf9细胞的形态变化  43-44
  3.10 重组蛋白的SDS-PAGE分析  44-48
  3.11 重组蛋白的WESTERN-BLOT分析  48-51
4 讨论  51-54
  4.1 杆状病毒表达系统  51-52
  4.2 Sf9昆虫细胞的培养  52
  4.3 HCV结构蛋白的表达  52
  4.4 蛋白收获的时间  52-54
5 结论  54-55
参考文献  55-61
致谢  61

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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