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PI3K/PKB信号通路及其抑制剂wortmannin在大鼠急性胰腺炎相关肾损伤中的作用

作　者: 丁若坤
导　师: 冯志杰
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 急性胰腺炎肾损伤 PI3K∕PKB wortmannin 中性粒细胞肿瘤坏死因子α
分类号: R576
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

急性胰腺炎(Acute pancreatitis AP)中重症急性胰腺炎(Sever acute pancreatitis SAP)占10%-25%,病死率高达20%-30%左右,常伴多器官功能障碍综合症(Multiple-organ dysfunction syndrome MODS)。其中急性肾功能障碍发生率仅次于急性肺功能障碍,大约为14%～43%。关于AP肾损伤的发病机制目前仍不十分清楚,肾血流动力学的改变及肾微循环障碍、细菌移位和内毒素、炎症介质、细胞因子、氧自由基等多种因素参与了重症急性胰腺炎并肾损害的发展过程。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase PI3K)是一种与细胞内信号转导有关的第二信使,蛋白激酶B(protein kinase B PKB)是PI3K的一个下游作用因子,PI3K/PKB信号通路是一个重要的信号调控系统,可介导细胞外信号引起细胞反应,在肿瘤的发生,炎症细胞的活化,趋化,缺血再灌注,间质纤维化等方面发挥了重要作用。近年来PI3K/PKB信号通路与胰腺炎的关系引起更多关注,PI3K/PKB信号通路通过促进Ca2+由钙库释放入胞质,参与了胞内钙超载的形成,进而激活胰蛋白酶原,参与胰腺炎的发生。同时有研究表明,该信号通路通过促进中性粒细胞的募集及产生TNF-α、IL-1β等大量炎症介质,加重了急性胰腺炎时的胰腺损伤。通常情况下磷酸化的PKB可衡量PI3K/PKB信号通路的活化程度。本实验通过测定肾组织中磷酸化PKB (phophorylated protein kinase B,p-PKB)及PKB的表达水平,进而研究PI3K/PKB信号通路与大鼠AP相关肾损伤的关系,同时应用PI3K信号通路抑制剂wortmannin干预AP大鼠,观察其在AP大鼠并发肾损伤的作用并研究其可能的机制。目的:通过应用PI3K的特异性抑制剂wortmannin预处理大鼠AP模型,探讨wortmannin在急性胰腺炎相关肾损伤中的作用,并研究其可能的作用机制。方法:将健康成年SD大鼠54只随机分为对照组(sham operation, SO)、急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)组和AP+wortmannin(WAP)组,每组18只,每组又以不同时间点3h、6h、12h分为三个亚组,每个亚组6只大鼠。以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中切口进入腹腔,以无创动脉夹夹闭近肝门端胰胆管,应用以0.2 ml/min速度逆行胰胆管注射50g/L牛磺胆酸钠制备AP模型(1ml/kg)。推药后以左手拇指捏闭胰管入十二指肠处,观察3 min,去除动脉夹,其中AP组于造模前4小时腹腔注射wortmannin(0.35mg/kg)。SO组和AP组均于造模前4小时腹腔注射DMSO(dimethylsulfoxide)(0.35mg/kg),DMSO为wortmannin的溶剂。分别于建模后3h, 6h, 12h每组于无菌环境下处死6只大鼠,下腔静脉取血,检测血清TNF-α(tumour necrosis factor-α)水平、血清淀粉酶、肌酐、尿素氮的水平,并留取肾脏和胰腺以观察胰腺和肾脏的大体及病理学改变,并检测肾组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,通常情况下PKB的磷酸化可衡量PI3K的活性,采用western blot检测肾组织中PKB及p-PKB (phosphorylated protein kinase B)的表达水平,观察PI3K/PKB信号通路与大鼠AP相关肾损伤的关系,及应用wortmannnin预处理AP大鼠后上述测量指标的变化。结果:SO组的各测量指标在各时间点无明显变化,AP组在各时间点较SO组血清TNF-α水平,血清淀粉酶、肌酐、尿素氮,及肾MPO活性均显著升高( P < 0. 05) ,胰腺、肾病理损伤亦较SO组明显加重;AP组的肾组织在各时间点的中性粒细胞的浸润随时间的延长而增多。WAP组在各时间点较SO组各项指标均升高,但与AP组相比均明显降低( P < 0. 05)。本实验中应用MPO代表中性粒细胞的浸润程度,SO组大鼠在3h、6h、12h各时间点,肾脏MPO活性测定为:(1.04±0.17)U/g、(1.02±0.17)U/g、(1.05±0.19);AP组分别为(2.12±0.26)U/g、(7.45±0.41)U/g、(9.97±0.23)U/g;WAP组分别为(1.59±0. 20)U/g、(4.48±0.23)U/g、(6.14±0.20)U/g。MPO的活性在各时间点,SO组无显著变化, AP组各时间点MPO活性较SO组明显升高( P < 0. 05 ),随时间延长逐渐增高;WAP组较之AP组比较明显下降( P < 0. 05 ),但仍较前SO组明显增高( P < 0. 0 5 )。不同时间点各组血清TNF-α为:在3h、6h、12h各时间点,SO组分别为(78.2±17.62)ng/L、(75.86±16.58) ng/L、(67.13±12.55) ng/L;AP组分别为(274.57±22.37) ng/L、(500.39±30.96) ng/L、(764.83±41.61) ng/L;WAP组分别为(170.60±25.99)ng/L、(312.31±35.66)ng/L、(397.21±33.45)ng/L。在各时间点,SO组TNF -α无显著变化,AP组各时间点血清TNF -α浓度较SO组明显升高( P < 0. 05 ),随时间延长逐渐增高;WAP组血清TNF -α浓度较之AP组比较明显下降( P < 0. 05 ),但仍较前SO组明显增高( P < 0. 0 5 )。western blot检测肾组织中PKB的表达在三个组比较没有明显差别,而p-PKB的表达,在AP组和WAP组均较正常对照组明显升高,WAP组较AP组明显降低( P < 0. 0 5 )。结论: AP大鼠模建立后,胰腺组织出现病理损伤,炎症细胞的浸润及坏死程度随时间的延长而加重,说明AP模型建立成功,引发AP时,大鼠肾组织中p-PKB的水平明显升高,表明PI3K∕PKB信号通路参与了AP大鼠相关肾损伤的发生发展,应用wortmannin预处理AP大鼠后,肾组织中p-PKB的水平较AP组明显下降,说明wortmannin抑制了PI3K∕PKB信号通路,同时肾脏的大体和病理学改变明显减轻,血清肌酐及尿素氮水平明显下降,募集到肾组织的中性粒细胞明显减少,血清中TNF-α的水平明显下降,表明应用wortmannin预处理AP大鼠,可减轻急性胰腺炎大鼠相关肾损伤,其作用机制可能与抑制TNF-α等炎症因子的释放以及中性粒细胞的聚集等有关。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-12
前言  12-14
材料和方法  14-24
结果  24-27
附图  27-40
附表  40-43
讨论  43-48
参考文献  48-50
综述  50-62
  参考文献  58-62
致谢  62-63
个人简历  63

PI3K/PKB信号通路及其抑制剂wortmannin在大鼠急性胰腺炎相关肾损伤中的作用

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