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猪C3d分子佐剂增强PRRSV GP5核酸疫苗免疫效果的研究

作　者: 夏庆祥
导　师: 牛钟相
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV C3d-p28佐剂 GP5基因疫苗免疫效果
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

基因疫苗主要是由真核表达载体和保护性抗原基因构成的,与传统疫苗相比较,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗同时存在抗体产生慢且水平低的问题,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺点。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子ɑ链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。C3d可以直接与抗原递呈细胞(APC)上的CR2受体结合,降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此C3d被认为是基因疫苗的有效的分子佐剂。猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是以母猪流产及仔猪呼吸系统障碍为主要病征的传染病,病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。该病毒传染性强,而且感染机体后致免疫抑制及各种并发症,给养猪业造成巨大危害和经济损失。病毒基因的变异也给防治增加了难度。糖基化囊膜蛋白5(GP5)是PRRSV的主要结构蛋白,具有结合细胞受体及诱导细胞凋亡等功能,而且该蛋白能诱导中和抗体产生,是新型疫苗设计的主要靶蛋白。本实验构建了pcDNA3.1-GP5-p28.n(2、4、6)重组质粒,并对其免疫效果进行了初步研究,主要研究内容如下:采集经油乳剂灭活苗免疫刺激的长白猪肝组织提取肝脏总RNA,RT-PCR扩增获得C3d基因的cDNA,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌BL21,酶切鉴定后测序。PCR结果显示,在888bp处有一明亮条带,与预期大小一致;经测序发现与长白猪C3d基因的同源性为99.9%,证明获得猪C3d基因。将猪C3d基因与鼠和鸡的C3d基因同源性比较,结果分別为81.9%和67.2%。分析猪C3d的CR2结合区,发现该区为28个氨基酸,且哺乳动物的CR2结合区的同源性较高(近80%),与禽类CR2结合区的同源性仅为40%,显示出明显的种属差异性。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P28至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P28.n。酶切获得P28.n,将其克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)。最后RT-PCR扩增PRRSV-GP5基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P28.n中P28.n的上游,构建完成pcDNA3.1-GP5-p28.n(2、4、6)重组质粒。酶切鉴定证明成功构建了pcDNA3.1-GP5-p28.n(2、4、6)重组质粒。大量提取重组质粒,转染Marc 145细胞,经间接免疫荧光证明重组质粒能在细胞内表达。重组质粒免疫小鼠,通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平,结果显示,抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高,且以pcDNA3.1-GP5-P28.6组的效果最好,与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显著(P<0.05)。证明该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,补体C3d-P28分子佐剂能显著增强PRRSV GP5基因的免疫效果。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-35
  1.1 DNA 疫苗的研究进展  13-25
    1.1.1 核酸疫苗的研究历史  13
    1.1.2 核酸疫苗的组成结构  13-14
    1.1.3 DNA 疫苗的免疫机制  14-16
    1.1.4 核酸疫苗的优点及其不足  16-18
      1.1.4.1 核酸疫苗的优点  16-18
      1.1.4.2 核酸疫苗的不足  18
    1.1.5 影响DNA 免疫效果的主要因素  18-19
      1.1.5.1 目的基因的选择  18
      1.1.5.2 载体及启动子的选择  18-19
      1.1.5.3 增强剂和佐剂的应用  19
      1.1.5.4 接种途径和剂量  19
      1.1.5.5 接种前动物组织的预处理  19
    1.1.6 增强DNA 疫苗免疫效果的策略  19-25
      1.1.6.1 细胞因子基因佐剂  19-21
      1.1.6.2 共刺激分子  21-22
      1.1.6.3 补体佐剂  22
      1.1.6.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS）  22-23
      1.1.6.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）  23
      1.1.6.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD）  23
      1.1.6.7 模拟或增强MHC 作用  23-24
      1.1.6.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力  24
      1.1.6.9 提高抗原处理能力  24-25
      1.1.6.10 双作用子的应用  25
  1.2 补体C3d 研究进展  25-30
    1.2.1 C3d 的分子结构  26
    1.2.2 C3d 的分子佐剂作用  26-28
    1.2.3 C3d 分子佐剂作用的可能机制  28-30
  1.3 PRRSV 及其GP5 基因  30-34
    1.3.1 PRRSV 的病原学特征  31-32
    1.3.2 基因组特征  32-33
    1.3.3 GP5  33-34
  1.4 本研究的目的及意义  34-35
2 材料和方法  35-51
  2.1 材料  35-37
    2.1.1 菌株和毒株  35
    2.1.2 载体  35
    2.1.3 试剂  35
    2.1.4 试验动物  35
    2.1.5 主要仪器  35
    2.1.6 试验所用溶液及其配制  35-36
    2.1.7 RT-RCR 试验所用物品的准备和处理  36-37
  2.2 方法  37-51
    2.2.1 猪C3d 基因的克隆及鉴定  37-41
      2.2.1.1 猪的免疫刺激  37
      2.2.1.2 猪肝脏总RNA 提取  37-38
      2.2.1.3 引物设计  38
      2.2.1.4 RT-PCR 扩增C3dcDNA  38-39
      2.2.1.5 目的条带回收  39
      2.2.1.6 制作感受态细胞  39-40
      2.2.1.7 PCR 产物与pMD18-T 的连接及转化  40
      2.2.1.8 阳性克隆鉴定  40-41
    2.2.2 重组质粒的构建  41-45
      2.2.2.1 P28 串联体的构建  41-45
    2.2.3 PRRSV GP5 基因的RT-PCR 扩增  45
    2.2.4 插入抗原基因  45-46
    2.2.5 重组质粒的大量提取  46-47
    2.2.6 重组质粒在Marc-145 细胞的表达  47-48
      2.2.6.1 Marc-145 细胞的制备  47
      2.2.6.2 pcDNA-GP5-P28.6 阳性重组质粒转染Marc145 细胞  47-48
      2.2.6.3 间接免疫荧光观察转染细胞  48
    2.2.7 重组质粒免疫效果的检测  48-51
      2.2.7.1 LSI ELISA 试剂盒检测 PRRSV GP5 特异性抗体  49
        2.2.7.1.1 操作步骤  49
        2.2.7.1.2 试验结果的判定  49
      2.2.7.2 小鼠血清中IL-4 的检测  49-50
      2.2.7.3 小鼠血清中IFN-γ的检测  50-51
3 结果  51-60
  3.1 猪C3d 的克隆及鉴定结果  51-54
    3.1.1 RT-PCR 扩增猪C3dcDNA 及酶切鉴定结果  51-52
    3.1.2 猪C3d cDNA 的测序结果  52-54
      3.1.2.1 猪C3d 基因序列  52-53
      3.1.2.2 猪C3d 基因序列分析  53-54
  3.2 构建P28 串联体  54-55
    3.2.1 P28 基因的克隆  54
    3.2.2 P28 串联体的构建  54-55
  3.3 RT-PCR 扩增PRRSV GP5 基因  55-56
  3.4 pCDNA-GP5-P28.n（2、4、6）重组质粒的构建  56
  3.5 重组质粒pCDNA-GP5-P28.n（2、4、6）的效果研究  56-60
    3.5.1 重组质粒在细胞内的表达  56-57
    3.5.2 重组质粒对小鼠的免疫效果  57-60
      3.5.2.1 对小鼠体液免疫（抗体水平）增强结果  57-58
      3.5.2.2 对小鼠细胞免疫（IL-4 和IFN-γ的含量）增强结果  58-60
4 讨论  60-63
  4.1 C3d 分子佐剂研究  60
  4.2 C3d 基因的克隆及序列分析  60-61
  4.3 pcDNA3.1-GP5-p28.n 重组质粒的构建  61-62
  4.4 影响细胞转染的因素  62
  4.5 重组质粒免疫效果的检测  62-63
5 结论  63-64
6 参考文献  64-76
7 致谢  76-77
8 攻读学位期间发表论文情况  77-78
硕士学位论文内容简介及自评  78

猪C3d分子佐剂增强PRRSV GP5核酸疫苗免疫效果的研究

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