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携Hsp70序列的PRRSV GP5、M蛋白基因核酸疫苗构建及其小鼠免疫实验研究

作　者: 左兰
导　师: 颜其贵；郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV 核酸疫苗 Hsp70 小鼠免疫
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),是一种以引起猪繁殖障碍和呼吸道疾病为主要特征的急性传染病。不同品种、性别、年龄的猪只均可感染,该病流行范围广,发病率高,严重影响了养猪业的健康发展。研究表明,在PRRSV结构基因中目前已知的具有良好免疫原性的糖蛋白主要有GP4(ORF4编码)、E (ORF5编码)和M (ORF6编码)。其中,E、M蛋白具有诱发中和抗体的能力,M蛋白还具有诱发特异性细胞免疫功能。因此,E、M蛋白基因是开发PRRS核酸疫苗重要的候选基因。同时,研究表明Hsp70具有免疫优势抗原的特点,能诱导出特异性Thl型细胞反应,能参与调节提高机体的免疫反应。基于此,本研究以PRRSVSCQ株的ORF5、ORF6以及卡介苗(结核杆菌的减毒菌)中的Hsp70为研究对象,构建了含有Hsp70和PRRSV ORF5、ORF6的核酸疫苗；通过小鼠免疫实验,分析该核酸疫苗在小鼠体内诱导的免疫水平与效果,为进一步研究PRRS核酸疫苗在临床上应用提供基础数据和实践依据。本课题主要研究内容包括：Ⅰ.携Hsp70序列的PRRSV ORF5、ORF6基因重组质粒构建及表达研究本研究在实验室原有构建好的质粒pMD 19-T-ORF5、pMD 19-T-ORF6、pMD19-T-Hsp70的基础上,参照GenBank中收录的PRRSV SCQ株基因序列,重新设计4对引物,将ORF5、ORF6、Hsp70基因进行扩增,分别克隆至SimplepMD19-T载体上,经PCR、双酶切和序列测定鉴定正确后,将其分别命名为pMD19-T-ORF5、pMD19-T-ORF6、pMD19-T-Hsp70;将ORF5与ORF6基因串联,克隆至Simple pMD19-T载体上,获得串联基因ORF5-ORF6,经PCR、EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切和序列测定鉴定正确,将其命名为pMD19-T-ORF5-ORF6;回收鉴定正确的重组质粒pMD19-T-ORF5-ORF6中的ORF5-ORF6片段,将其克隆至表达载体pCI-neo,成功获得重组表达质粒：含终止密码子的pCI-ORF5-ORF6A与不含终止密码子的pCI-ORP5-ORF6B。然后经EcoRⅠ和XbaⅠ鉴定重组质粒,XbaⅠ和SmaⅠ酶切回收Hsp70,与pCI-ORF5-ORF6B一起构建融合表达质粒pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70;将重组质粒转染COS-7细胞进行表达研究,经IFA方法检测,结果显示转染重组质粒pCI-ORF5-ORF6A及pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的Cos-7细胞浆中均出现特异性的绿色荧光；Western-blotting分析结果显示,重组质粒的表达蛋白分别在42.7Ku、112.2 Ku出现反应条带,大小与预期大小相符,说明ORF5、ORF6、Hsp70蛋白具有一定的生物学免疫反应活性。重组质粒的成功表达为进一步进行PRRS核酸疫苗动物免疫实验奠定了基础。Ⅱ.核酸疫苗pCI-ORF5-ORF6A、pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70在小鼠体内的免疫效果研究将重组质粒免疫小鼠,同时设定PRRS活疫苗、pCI-neo空载体及空白对照组,免疫三次,每次间隔14天,每隔2周尾尖采血分离血清,检测细胞因子IFN-γ、IL-4、脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)、淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平及中和抗体水平。IL-4和IFN-γ检测显示,各免疫组IL-4和IFN-γ的含量都有明显变化。其中,pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70疫苗组诱导机体产生的IL-4和IFN-y量均显著高于pCI-ORF5-ORF6A诱导机体产生的IL-4和IFN-y量(P<0.01)。表明Hsp70作为分子佐剂能有效地刺激机体表达IL-4和IFN-y的能力；淋巴细胞亚类检测结果表明,两组中CD4+、CD3+T淋巴细胞亚类数量显著高于空质粒pCI-neo对照组、PBS对照组,CD8+T淋巴细胞亚类数量也高于两对照组；MTT实验显示,免疫前各组脾淋巴细胞增殖能力差异不显著(P>0.05),随着免疫次数的增加,至三免后14d pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70组的脾淋巴细胞增殖能力与对照组及pCI-ORF5-ORF6A差异显著(P<0.05),证明Hsp70作为佐剂能有效的刺激脾淋巴细胞的增殖。小鼠免疫实验说明,所构建的含Hsp70的PRRSV共表达基因ORF5/ORF6核酸疫苗能有效诱导机体的体液与细胞免疫应答水平。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
符号说明  9-13
第一章 文献综述  13-25
  1. 猪繁殖与呼吸综合征研究进展  13-21
    1.1 PRRSV概述  13
    1.2 PRRSV病毒学特性  13-14
    1.3 病毒基因组结构  14-15
    1.4 PRRSV主要结构蛋白  15-16
    1.5 PRRSV的检测与诊断方法  16-18
      1.5.1 病毒分离  16-17
      1.5.2 PRRSV抗原检测技术  17-18
      1.5.3 PRRSV抗体检测技术  18
    1.6 PRRS疫苗的研制  18-21
      1.6.1 常规疫苗  18-19
      1.6.2 基因疫苗  19-20
      1.6.3 活载体疫苗  20
      1.6.4 亚单位疫苗  20-21
  2. 热休克蛋白70研究进展  21-23
    2.1 热休克蛋白概述  21
    2.2 Hsp70的结构及特点  21
    2.3 Hsp70的生物学功能  21-23
      2.3.1 分子伴侣功能  21-22
      2.3.2 耐热性功能  22
      2.3.3 介导蛋白跨膜转运  22
      2.3.4 增强免疫反应功能  22-23
  3 研究目的与意义  23-25
第二章 核酸疫苗pCI-ORF5-ORF6A与pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建及小鼠免疫研究  25-63
  1. 实验材料  25-28
    1.1 质粒、菌株与细胞  25
    1.2 主要试剂  25
    1.3 溶液的配制  25-28
    1.4 主要仪器  28
  2 方法  28-49
    2.1 重组表达质粒pCI-ORF5-ORF6A和pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建与鉴定  28-39
      2.1.1 引物设计与合成  28-29
      2.1.2 重组表达质粒pCI-ORF5-ORF6A和pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建图  29
      2.1.3 表达目的基因片段ORF5、ORF6(6A、6B)、Hsp70的克隆  29-35
      2.1.4 pMD19-T-ORF5-ORF6重组质粒的构建  35-37
      2.1.5 真核表达载体pCI-ORF5-ORF6A的构建  37-38
      2.1.6 真核表达载体pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的构建  38-39
    2.2 质粒转染及表达产物的检测  39-44
      2.2.1 质粒pCI-ORF5-ORF6A与pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70 DNA的小量抽提与纯化  39-41
      2.2.2 质粒DNA的转染  41
      2.2.3 表达产物的间接免疫荧光试验(IFA)  41-42
      2.2.4 融合蛋白表达产物免疫印迹分析(Western-blotting)  42-44
    2.3 重组质粒的免疫原性研究  44-49
      2.3.1 重组质粒DNA的大量制备及纯化  44-45
      2.3.2 质粒DNA动物免疫  45
      2.3.3 淋巴细胞转化实验  45-46
      2.3.4 CD~(4+)、CD~(8+)T细胞亚群数量检测  46-47
      2.3.5 IL-4和IFN-γ细胞因子检测  47-48
      2.3.6 小鼠血清中和抗体检测  48-49
  3. 试验结果  49-59
    3.1 表达目的基因片段ORF5、ORF6(6A、6B)、Hsp70的克隆  49-51
      3.1.1 PRRSV ORF5、ORF6基因及Hsp70基因的PCR扩增  49-50
      3.1.2 pMD19-T-ORF5、pMD19-T-ORF6A、pMD19-T-ORF6B和pMD19-T-Hsp70质粒的酶切鉴定  50-51
      3.1.3 序列测定  51
    3.2 串联融合表达基因的连接  51-52
      3.2.1 pMD19-T-ORF5-ORF6A、pMD19-T-ORF5-ORF6B质粒的酶切鉴定  51-52
      3.2.2 序列测定  52
    3.3 pCI-ORF5-ORF6A、pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70真核表达载体构建  52-53
      3.3.1 pCI-ORF5-ORF6A、pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70质粒的酶切鉴定  52-53
    3.4 重组质粒在COS-7细胞中的表达  53-55
      3.4.1 IFA检测  53-54
      3.4.2 Western-blotting检测  54-55
    3.5 重组质粒的免疫原性研究  55-59
      3.5.1 淋巴细胞转化实验  55
      3.5.2 脾T-淋巴细胞亚群数量检测  55-56
      3.5.3 IL-4和IFN-γ细胞因子检测  56-57
      3.5.4 中和抗体检测结果  57-59
  4. 讨论  59-63
    4.1 外源基因的选择  59-60
    4.2 真核重组表达载体的选择  60
    4.3 真核重组表达质粒表达外源基因水平的讨论  60-61
    4.4 Hsp70与ORF5、ORF6基因融合表达PRRSV核酸疫苗诱导的免疫反应  61-63
全文小结  63-64
参考文献  64-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表的学术论文目录  72

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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