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抗FMDV核酶的筛选及其重组成纤维细胞株的建立

作　者: 崔力凡
导　师: 张强
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 锤头状核酶口蹄疫病毒 G418筛选
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 36次
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内容摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是一种世界性分布的传染病,具有传播速度快、感染力强、偶蹄类动物易感等特性。口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）具有7个血清型和80个以上的亚型,该病毒各型之间无交叉免疫力,且非常容易发生变异。这些特点使得该病在世界范围内不断暴发流行,给畜牧业造成了巨大的损失。目前,世界各国除了研制开发FMD新型疫苗外,还积极探索其他有效的预防策略,如利用转基因技术提高动物自身对FMD的抵抗能力,以达到防止该病流行的目的。核酶是一类具有催化活性的小RNA,它可以特异性的结合并切断病毒RNA,使病毒失活。此外,核酶不影响宿主细胞mRNA的正常活性,所以它是一种高效的、安全的新型酶。锤头状核酶是核酶家族众多成员中的一员,较其它核酶具有分子量小、结构简单、作用位点特异等优点,目前已被许多国内外学者运用到疾病基因治疗的研究中,为抗FMDV的研究提供了一个新的思路。我们可以通过转基因技术使动物自身表达抗FMDV的核酶,使病毒在动物体内不能复制及表达,以达到抗FMD的目的。在对O型FMDV CHA/99毒株2B、3D基因的RNA二级结构进行预测的前提下,根据锤头状核酶的设计原则,针对2B及3D基因片段寻找到6个锤头状核酶的催化作用位点,设计并合成出特异性的锤头状核酶;构建pEGFP-N₁-2B、pEGFP-N₁-3D重组表达质粒,分别与对应的锤头状核酶共转染BHK-21细胞,通过荧光显微镜观察及流式细胞检测的方法筛选出有效的核酶,在细胞水平上检测其对FMDV的抑制效果。将筛选出的核酶基因构建重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-D42,转染山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得单克隆细胞株,经扩大培养后用RT-PCR的方法进行验证。荧光显微镜下观察共转染的BHK-21细胞,发现核酶D42能使荧光减弱,抑制了pEGFP-N₁-3D的表达;流式细胞检测结果进一步验证了核酶D42的催化效率,可高达71%;通过对细胞病变程度的观察发现,在相同时间内,转染了核酶D42的实验组病变细胞数目少于未转染核酶D42的阳性对照组,说明在细胞水平上D42对FMDV也有明显的抑制效果;将pGPU6/GFP/Neo-D42重组表达质粒转染入山羊成纤维细胞,用800μg/mL浓度的G418进行细胞筛选,12天后得到一株表达D42核酶的单克隆细胞株,挑取单克隆细胞并传代培养,RT-PCR结果表明D42核酶已成功整合到该单克隆细胞株中。本论文运用核酶催化原理抑制FMDV的复制,通过G418筛选获得了表达核酶D42的阳性细胞株,为核移植提供了供体细胞核,也为抗FMD转基因山羊的培育奠定了基础。

抗FMDV核酶的筛选及其重组成纤维细胞株的建立

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