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脐血造血干细胞对人肝癌细胞种植瘤抑制作用的初步研究

作　者: 陈奕明
导　师: 李立
学　校: 昆明医学院
专　业: 外科学
关键词: 羟乙基淀粉脐血造血干细胞 CD34 动物实验肿瘤细胞系肿瘤移植肿瘤标记脐血干细胞移植细胞分化
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

第一部分脐血造血干细胞的采集、分离、鉴定及冻存目的：分离脐血中的造血干细胞,鉴定后将其冻存,为后续实验提供所需的造血干细胞。方法：通过6%羟乙基淀粉自然沉淀法将脐血中的红细胞及有核细胞分离,并使用改良牛鲍式血细胞计数板进行有核细胞计数,流式细胞检测脐血中CD34+细胞含量,以二甲基亚砜、小牛血清、羟乙基淀粉构成的冻存保护剂将分离后的细胞冻存于-80℃冰箱,并使用苔盼蓝染色检测冻存、复苏前后的活细胞率。结果：6%羟乙基淀粉自然沉淀法分离脐血的有核细胞回收率为84.5%,分离前后CD34+细胞含量分别为1.3%和1.2%。脐血有核细胞在冻存4周后活细胞率由100%降至92%。结论：6%羟乙基淀粉自然沉降法能够有效地分离脐血中的有核细胞及造血干细胞。由二甲基亚砜、小牛血清、羟乙基淀粉构成的冻存保护剂能够在-80℃环境中有效地保存脐血有核细胞且无明显活性下降。第二部分人肝癌细胞系MHCC97-H的培养及BABL/c裸小鼠荷人肝癌肿瘤模型的建立目的：通过体外培养、扩增人肝癌细胞,制备足够的细胞,并通过皮下种植的方式建立BABL/c裸小鼠荷人肝癌种植瘤模型。方法：贴壁培养人肝癌细胞MHCC97-H细胞系,胰酶消化后传代,进行细胞扩增,将细胞接种于24孔培养板并计数。培养至所需的细胞数量后将细胞制备为单细胞悬液,调整浓度至2×106/0.2ml。按体积比1：1将细胞悬液与Matrivgel膜基质混合,按1×106/0.2ml接种于24只裸小鼠皮下,计算肿瘤潜伏期及成瘤率。将接种肿瘤细胞悬液的裸鼠随机分为两组,A组12只,作为后续实验的造血干细胞移植组；B组12只,作为空白对照组。结果：人肝癌细胞MHCC97-H细胞系倍增时间为35.12小时。14天内24只裸鼠中有23只成瘤,总成瘤率为95.83%。A组12只裸鼠全部成瘤,平均潜伏期为6.55±1.51天；B组中11只裸鼠成瘤,平均潜伏期为5.91±1.70天,两组平均潜伏期差别无统计学意义。结论：MHCC97-H是一个生长速度快,代谢旺盛的肿瘤细胞株。通过与Matrivgel膜基质的混合并皮下种植,可以在减少细胞用量的情况下有效地建立BABL/c裸鼠荷人肝癌种植瘤模型。第三部分脐血造血干细胞移植及其对人肝癌种植瘤生长的抑制作用目的：通过对裸小鼠荷人肝癌种植瘤模型进行脐血造血干细胞移植,观察其对种植瘤生长的影响。方法：A组实验组裸鼠每隔7天经尾静脉经行造血干细胞移植,B组作为空白对照组。每次移植后24小时以游标卡尺测量并计算两组间肿瘤体积的差别,4周后处死所有裸鼠,取出肿瘤,计算肿瘤体积。每次造血干细胞移植后24小时取A、B组各6只裸鼠断尾取血,以ELISA测定裸鼠血清中肿瘤标记物DCP、AFP-L3的水平变化,判断肿瘤标记物的变化与肿瘤体积的变化是否存在相关性,并比较组间差别。A组中未取血的6只裸鼠断尾取血,以流式细胞技术检测移植后的造血干细胞在裸鼠体内分化的CD4+、CD20+细胞情况,判断其变化与组间肿瘤体积差别变化是否存在相关性。结果：首次造血干细胞移植后两周两组裸鼠肿瘤体积差别出现显著性差异(A组387.75±25.77mm3,B组439.31±55.66mm3,P<0.05)。组间DCP于首次造血干细胞移植后1周出现显著性差异(A组9.36±0.76ng/ml,B组11.12±1.38ng/ml,P<0.05),且与肿瘤体积变化高度相关(r=0.940,P<0.05),而组间AFP-L3水平差别无显著性差别,与肿瘤体积变化无相关性(r=0.254,P>0.05)。造血干细胞移植后,裸鼠全血中CD4+及CD20+细胞含量进行性增加,且与组间肿瘤体积差别变化幅度中度相关(r=0.642,r=0.707,P<0.05)。结论：脐血造血干细胞移植能够抑制人肝癌种植瘤的生长,肿瘤体积的变化与血清肿瘤标记物DCP的变化高度相关,造血干细胞对肿瘤的抑制作用可能通过其分化产生的免疫效应T、B淋巴细胞发挥作用。

全文目录

中文摘要  7-10
Abstract  10-14
引言  14-16
  参考文献  15-16
第一部分  16-28
  前言  16-17
  材料与方法  17-22
  结果  22-24
  讨论  24-26
  小结  26
  参考文献  26-28
第二部分  28-42
  前言  28-29
  材料与方法  29-33
  结果  33-38
  讨论  38-40
  小结  40
  参考文献  40-42
第三部分  42-64
  前言  42-43
  材料与方法  43-48
  结果  48-58
  讨论  58-61
  小结  61
  参考文献  61-64
附图  64-66
全文总结  66-68
综述  68-77
  参考文献  73-77
攻读学位期间论文发表情况  77-78
致谢  78

脐血造血干细胞对人肝癌细胞种植瘤抑制作用的初步研究

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