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利用复合有TGF-β1的微孔滤膜诱导大鼠牙乳头细胞生成牙本质的研究
作 者: 倪伟嘉
导 师: 倪龙兴;李玉成
学 校: 第四军医大学
专 业: 口腔内科学
关键词: 牙乳头 微孔滤膜 成牙本质细胞分化 牙本质再生
分类号: R78
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
牙乳头(dental papillae)由未分化间充质细胞组成,是牙胚发育过程中的一过性组织,密集分布于成釉器下方,是成牙本质细胞细胞的来源组织,对牙本质形成发挥主要作用。原发性牙本质(primary dentine)是牙齿发育完成之前形成的牙本质,它的形成受到上皮与牙源性间充质相互作用的控制,这种调节是通过基底膜(basement membrane, BM)介导的。基底膜是由一层特殊的薄片状细胞外基质(extracellular matrix, ECM)构成,位于上皮与牙源性间充质之间,作为一个动态结构参与了多种细胞分化和功能构建。基底膜是诱导成牙本质细胞分化与促进牙本质形成的天然支架。它是牙源性上皮组织的诱导下由间充质和上皮共同形成的纤维网状结构,但在成体情况下,上皮来源的组织随着牙齿的发育成熟逐渐萎缩消失。因此,找到一种能够仿照上皮发挥诱导作用的途径对于基底膜的形成和牙本质的再生就显得十分关键。有学者研究发现,结合有牙本质基质蛋白(DMP)或TGF-β的微孔滤膜在狗的穿髓模型中能够诱导成牙本质细胞分化和形成牙本质,促进修复性牙本质对病损部位的防御。我们想到能否用类似的方法用于组织工程化牙本质的研究呢?可以设想在牙本质再生过程中找到一种膜性材料能够部分发挥基底膜的功能,从而诱导形态规则的管状牙本质的形成,以达到预期的生成效果。为此我们设计了以下实验:1.牙乳头组织与复合有TGF-β1微孔滤膜结合后诱导成牙本质细胞样细胞分化的体外实验取出生后4d仔鼠,处死后浸入75%乙醇中15s。无菌条件下分离上下颌,体视显微镜下在PBS液中将颌骨骨板挑开,分离第一和第二磨牙牙胚,将磨牙胚外软组织去净后,机械分离成釉器和牙乳头,将分离的牙乳头组与复合有TGF-β的微孔滤膜相结合,放置于Millicell插入式培养皿中培养。一周后取出培养物,4%多聚甲醛固定24小时,用于扫描电镜观察、HE和免疫组织化学染色。结果表明牙乳头组织细胞在滤膜表面贴附生长,细胞突起伸入滤膜孔径中,与滤膜牢固结合;HE染色显示牙乳头组织与微孔滤膜结合紧密,沿着微孔滤膜观察到呈层状排列的细胞,细胞高度大体一致,部分细胞呈极化状态,垂直于滤膜表面。免疫荧光染色DSP及DMP-1可见贴附滤膜表面的细胞呈阳性。2.牙乳头组织与复合有TGF-β1微孔滤膜结合后诱导牙本质样结构再生体内实验取出生后4d的仔鼠,处死后浸入75%乙醇中15s。无菌条件下分离上下颌,体视显微镜下在PBS液中将颌骨骨板挑开,分离第一和第二磨牙牙胚,将磨牙胚外软组织去净后,机械分离成釉器和牙乳头。体视显微镜下剪开牙乳头,将准备好的微孔滤膜置入,在DMEM中37℃培养箱中孵育24小时,制备好的重组体用于移植。将体重约300g SD大鼠暴露肾脏,将重组体植入肾被膜下。14天后取移植物检测。结果可见层状矿化物在微孔滤膜表面上方形成,厚度均匀一致,矿化物结构致密。移植物HE染色可见大量矿化基质沿微孔滤膜沉积,矿化物厚度较一致,在基质表面有极化的成牙本质细胞样细胞分布。DSP与DMP-1免疫荧光染色,提示在靠近矿化基质的成牙本质样细胞表达阳性,呈带状分布。3.牙乳头细胞团与复合有TGF-β1微孔滤膜结合后诱导成牙本质细胞样细胞分化的体外实验取出生后4d仔鼠,分离出牙乳头组织,将其剪成1mm3大小组织块,消化培养原代牙乳头细胞。铺满后传代。待第二代细胞铺至80~90%,消化离心成团,移至准备好的微孔滤膜上,一起放入含血清的DMEM中,37℃,5%CO2孵箱中培养7d。取出培养物,4%多聚甲醛固定48h,用于扫描电镜观察、HE及免疫组化染色。结果显示细胞团在微孔滤膜上生长良好,一部分细胞突起深入滤膜的孔径中,HE染色显示细胞团与微孔滤膜界限清晰,靠近微孔滤膜的细胞极化,垂直于滤膜排列,形态发生高柱状变化。免疫荧光染色可见DSP和DMP-1在沿微孔滤膜分布的高柱状分化细胞呈弱阳性表达.4.牙乳头细胞团与复合有TGF-β1微孔滤膜结合后诱导牙本质样结构再生体内实验取出生后4d的仔鼠,分离出牙乳头组织后,将牙乳头组织剪成1mm3大小组织块,消化培养原代牙乳头细胞。铺满后传代。待第二代细胞铺至80~90%,消化离心成团,移至准备好的微孔滤膜上,置于DMEM中37℃培养箱中孵育24小时,制备好的重组体被用于移植。将体重约300g SD大鼠暴露肾脏,将重组体植入肾被膜下。饲养14天后大鼠脱颈处死,取移植物用于检测。结果显示:大量矿化基质沿微孔滤膜沉积,基质厚度较一致,矿化部分呈现管状牙本质样结构。在基质表面有排列整齐的成牙本质细胞样细胞分布。DSP和DMP-1免疫荧光染色中靠近基质的高柱状细胞表达阳性,在周围的软组织中偶见表达。
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全文目录
缩略语表 5-6 中文摘要 6-10 英文摘要 10-15 前言 15-16 文献回顾 16-28 一 成牙本质细胞分化与牙本质生成 16-22 二 牙齿再生的研究 22-28 正文 28-56 实验一 牙乳头组织与复合有TGF-Β1的微孔滤膜结合后诱导成牙本质细胞样细胞分化的体外实验 28-33 1 材料 28-29 2 方法 29-30 3 结果 30-32 4 讨论 32-33 实验二 牙乳头组织与复合有TGF-Β1的微孔滤膜结合后诱导牙本质样结构再生体内实验 33-39 1 材料 33-34 2 方法 34-35 3 结果 35-36 4 讨论 36-39 实验三 牙乳头细胞团与复合有TGF-Β1的微孔滤膜结合后诱导成牙本质细胞样细胞分化的体外实验 39-46 1 材料 39-40 2 方法 40-42 3 结果 42-44 4 讨论 44-46 实验四 牙乳头细胞团与复合有TGF-Β1的微孔滤膜结合后诱导牙本质样结构再生体内实验 46-56 1 材料 47 2 方法 47-48 3 结果 48-53 4 讨论 53-56 小结 56-57 参考文献 57-60 临床病例 60-69 个人简历和研究成果 69-70 致谢 70
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中图分类: > 医药、卫生 > 口腔科学
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