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平邑甜茶MhWRKY15基因的克隆及表达分析

作　者: 孙晓莉
导　师: 杨洪强
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 平邑甜茶 WRKY15基因分离 RNAi 拟南芥转化半定量RT-PCR
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 39次
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内容摘要

转录因子是结合在目的基因特定DNA序列上的蛋白质,它通过增强或抑制基因的转录效率来调控基因的表达水平,真核生物的基因表达调控主要是在转录水平进行。WRKY转录因子作为一种重要的诱导型调节因子,参与植物的多种防卫反应、生长发育调节以及物质代谢调节等各种重要生理活动。平邑甜茶（Malus hupehensis （Pamp） Rehd. var pinyiensis Jiang）是我国特有的植物资源,常用作苹果和观赏海棠的砧木。本研究以平邑甜茶为试材,克隆了MhWRKY15基因的全长cDNA序列,并运用生物信息学手段分析了其基因序列与编码蛋白的性质和功能;同时,研究了其在生长过程及逆境胁迫下的表达情况,并成功构建RNAi载体并转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株。主要结果如下:1).获得了平邑甜茶MhWRKY15基因,该基因cDNA全长1091bp,含有810bp的完整开放阅读框,编码269个氨基酸,属于WRKY类转录因子的第II组,为WRKY15家族成员。GenBank登录号为GU576874。2).生物信息学分析表明, MhWRKY15编码蛋白为可溶性蛋白,其分子式为C₁₂₆₃H₁₉₄₁N₃₆₅O₄₂₅S₁₂,相对分子量为29423.2Da,理论等电点为5.30;含有一个WRKY保守结构域,无跨膜域,无信号肽,存在磷酸化、N糖基化和O糖基化位点;其二级结构主要以无规则卷曲为主。3).构建了pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP表达载体,亚细胞定位结果表明平邑甜茶MhWRKY定位于细胞核。4).构建了基因沉默载体pFGC5941-RNAi-MhWRKY15,并通过花序侵染法转化拟南芥,通过抗性筛选和PCR检测,得到11株转基因再生阳性植株。5).半定量RT-PCR表明,平邑甜茶MhWRKY15基因的表达受NaCl、PEG、低温及机械伤害等胁迫诱导,并且具有组织特异性,叶片中的表达水平高于茎和根系。

全文目录

英文缩写符号及其中英文对照表  4-9
中文摘要  9-10
Abstract  10-12
1　前言  12-23
  1.1 WRKY 的结构特征及其分类  12-13
  1.2 WRKY 转录因子的结构域  13-14
  1.3 WRKY 转录因子的表达及其生物学功能  14-20
    1.3.1 WRKY 转录因子的表达特性  14-15
    1.3.2 WRKY 转录因子在植物防卫反应中的作用  15-17
    1.3.3 WRKY 转录因子在植物形态建成中的作用  17
    1.3.4 WRKY 转录因子在植物代谢中的作用  17-18
    1.3.5 WRKY 与MAPK 相互作用关系  18-20
  1.4 果树转录因子研究进展  20-22
  1.5 本研究目的和意义  22-23
2 材料与方法  23-37
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 试材  23
    2.1.2 菌株与质粒  23
    2.1.3 酶及生化试剂  23
    2.1.4 PCR 引物  23-24
  2.2 试验方法  24-37
    2.2.1 平邑甜茶总RNA 的提取  24-25
    2.2.2 RT-PCR 反转录合成cDNA  25-26
    2.2.3 MhWRKY15 全长序列的扩增  26-31
      2.2.3.1 巢式PCR 扩增MhWRKY15 中间片段  26-27
      2.2.3.2 3’-RACE 扩增3’端序列  27
      2.2.3.3 5’-RACE 获得5’端序列  27-31
    2.2.4 DNA 片段与克隆载体的连接  31
    2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  31-32
      2.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  31
      2.2.5.2 大肠杆菌感受态细胞的转化  31-32
    2.2.6 碱法小量质粒DNA 的提取  32
    2.2.7 凝胶电泳中DNA 片段的回收  32-33
    2.2.8 质粒DNA 的酶切鉴定  33
    2.2.9 DNA 序列测定  33
    2.2.10 pFGC5941-RNAi-MhWRKY15 表达载体的构建  33-34
    2.2.11 拟南芥转化及转化植株的PCR 鉴定  34-35
    2.2.12 pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP 表达载体的构建  35
    2.2.13 根癌农杆菌GV3101 和EHA105 感受态细胞的制备与转化  35-36
      2.2.13.1 根癌农杆菌感受态细胞制备  35-36
      2.2.13.2 冻融法转化农杆菌  36
    2.2.14 半定量RT-PCR 分析  36
    2.2.15 生物信息学分析  36-37
3 结果与分析  37-51
  3.1 平邑甜茶MhWRKY15 基因克隆与序列分析  37-44
    3.1.1 MhWRKY15 基因的分离  37-38
      3.1.1.1 MhWRKY15 中间片段的分离  37
      3.1.1.2 MhWRKY 15 3’片段的分离  37
      3.1.1.3 MhWRKY 15 5’片段的分离  37
      3.1.1.4 MhWRKY15 全长cDNA 的分离  37-38
    3.1.2 平邑甜茶MhWRKY15 基因的序列分析  38-39
    3.1.3 平邑甜茶MhWRKY15 编码蛋白的系统发生分析  39-41
      3.1.3.1 蛋白保守域分析  39
      3.1.3.2 系统进化树分析  39
      3.1.3.3 部分植物WRKY 蛋白序列多重比对  39-41
    3.1.4 平邑甜茶MhWRKY15 编码蛋白的性质及结构分析  41-44
      3.1.4.1 理化性质分析  41
      3.1.4.2 跨膜区域分析  41-42
      3.1.4.3 信号肽分析  42
      3.1.4.4 疏水性分析  42-43
      3.1.4.5 修饰位点分析  43
      3.1.4.6 二级结构及三级结构预测  43-44
  3.2 平邑甜茶MhWRKY15 蛋白的亚细胞定位  44-46
    3.2.1 pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP 表达载体的构建及亚细胞定位  44
    3.2.2 MhWRKY15 蛋白亚细胞定位的生物信息学预测  44-46
  3.3 平邑甜茶MhWRKY15 RNA 干扰载体的构建及拟南芥转化  46-49
    3.3.1 目的片段的克隆及重组子鉴定  46
    3.3.2 RNA 干扰载体的鉴定  46-49
  3.4 平邑甜茶MhWRKY15 基因的表达分析  49-51
    3.4.1 平邑甜茶根系中MhWRKY15 基因在不同胁迫下的表达分析  49-50
    3.4.2 平邑甜茶MhWRKY15 基因在不同发育期的表达分析  50-51
4 讨论  51-53
  4.1 平邑甜茶MhWRKY15 基因的生物信息学分析及表达特性  51-52
  4.2 平邑甜茶MhWRKY15 基因RNA 干扰载体的构建及拟南芥转化  52-53
5 结论  53-54
参考文献  54-61
致谢  61-62
攻读硕士学位期间完成论文情况  62-63
硕士学位论文内容简介及自评  63

平邑甜茶MhWRKY15基因的克隆及表达分析

内容摘要

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