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RNA干扰抑制Sp1对大肠癌SW480细胞端粒酶活性的影响

作　者: 赵利国
导　师: 程牛亮
学　校: 山西医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大肠癌 Sp1 RNAi hTERT 端粒酶
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景：大肠癌是西方国家最主要的恶性肿瘤之一，在我国近年来大肠癌发病率和死亡率不断上升的趋势也引起了广泛的关注。开展对大肠癌的分子生物学研究不仅对理解癌的本质有理论意义，而且对指导大肠癌的防治有实用价值。由于大肠癌的解剖组织学特点和肿瘤的生物学特性。大肠癌的独特之处在于其从正常粘膜到增生，从良性腺癌到恶变，从原位癌到浸润转移，各个阶段区分明确；从同一个体上往往可以同时获得从正常粘膜到转移癌发展不同阶段的组织标本用于比较研究，同时大肠癌可以明确区分为易感倾向遗传的遗传型及易感倾向不遗传的散发性，这就为研究大肠癌的细胞遗传学和分子遗传学提供了最好的材料。从分子生物学角度看大肠癌是目前研究最广泛，了解最透彻，性质最清楚的肿瘤，可以作为肿瘤发生过程中基因表达和结构改变的一个模式。肿瘤的发生和发展是目前肿瘤的研究热点，而端粒酶的激活与癌症高度相关，提示端粒酶、端粒和端粒维持间的互相影响是癌症衍变过程中至关重要的一步。研究表明端粒酶的活性在正常人体细胞中不表达或低表达,它存在于人的生殖细胞、肿瘤细胞、永生化细胞系和再生组织(例如,血液、皮肤和小肠上皮)中。人端粒酶复合体由3个主要的亚单位组成:端粒酶RNA组分( hTR) ,端粒酶相关蛋白( TP1 /TEP1 )和端粒酶催化亚单位( hTERT)。Sp1是结合到hTERT核心启动子GC富含位点和激活hTERT转录的关键分子。因此，应用RNA干扰(RNAi)技术抑制SW480细胞Spl基因的表达，进而抑制端粒酶活性，来影响肿瘤细胞的生长，将有助于进一步明确Sp1基因在大肠癌发生、发展中的作用及其可能机制，为大肠癌的预防和治疗提供切入点，在大肠癌的基因治疗方面有较大的应用前景。目的：1.构建针对Sp1基因的RNA干扰真核表达载体(pGenesil-1-Sp1，简写p-shRNA)；2.观察pGenesil-1-Sp1对大肠癌SW480细胞中Sp1基因的表达的抑制作用；3.检测Sp1沉默对大肠癌SW480细胞内hTERT及端粒酶活性的抑制作用方法：1.合成针对Sp1基因的短发夹结构真核表达载体pGenesil-1-Sp1与其对照载体pGenesil-1-CON(简写p-CON)经双酶切琼脂糖凝胶电泳及DNA测序鉴定；2.利用脂质体介导将真核表达质粒p-shRNA和p-CON转染人大肠癌细胞株SW480，提取总蛋白质，应用Western blot技术检测其对Sp1蛋白质表达水平的影响。3.利用RT-PCR检测转染后大肠癌细胞SW480的hTERT基因表达水平的变化情况4.利用TRAP-银染法检测转染后大肠癌细胞SW480的端粒酶活性变化情况5. MTT检测转染后大肠癌细胞SW480细胞活力6 .流式细胞术检测转染后大肠癌细胞SW480细胞的凋亡情况结果：1.酶鉴定和DNA测序证明成功构建了针对Sp1基因的RNA干扰真核表达载体；2.经MTT结果显示，SW480细胞转染重组质粒后，实验组A490值显著低于相同时间点对照组和正常组细胞，在24h、48h、72h、96h抑制率分别为29.03%、41.51%、42.25%、45.16%；表明抑制Sp1表达可能通过抑制hTERT的表达有效抑制SW480细胞的体外增殖能力。3.经流式细胞术检测发现，沉默Sp1后72 h后，沉默Sp1后72 h后，SW480细胞出现明显凋亡，其凋亡率为15.2%±1.99%，而阴性对照组细胞的凋亡率为2.7%±1.07%。说明Sp1基因沉默可能通过抑制hTERT的表达促进大肠癌细胞凋亡增加。4.转染SW480细胞后，各组中Sp1蛋白表达的灰度值为SW480/p-shRNA(0.55±0.11)，SW480/p-CON(0.84±0.10)，SW480(0.87±0.09)。转染pGenesil-1-Sp1后，可以抑制SW480细胞中Sp1蛋白的表达5. Sp1沉默后在SW480细胞中的hTERT的表达情况，经RT-PCR检测hTERT的mRNA水平,发现与对照组和空白组比较，转染pGenesil-1-Sp1(+)质粒的细胞中hTERT mRNA水平显著下调。说明转染pGenesil-1-Sp1(+)质粒的细胞中发生了针对hTERT mRNA的干扰效应。6.采用TRAP-PCR银染法检测端粒酶活性，结果显示干扰Sp1表达后，与正常组和对照组相比，干扰组SW480细胞TRAP分析特征性条带不明显，说明转染pGenesil-l-Spl(+)质粒能通过抑制Spl蛋白的表达来降低端粒酶活性结论：成功构建针对Sp1基因的RNA干扰质粒，可以有效抑制人大肠癌SW480细胞体外恶性增殖能力。其作用机制与Sp1基因沉默后降低hTERT表达从而下调端粒酶活性有关，为大肠癌基因治疗提供新的思路和方法。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
插图、附表清单  11-12
英文名称缩略词  12-13
前言  13-17
第一章材料与方法  17-35
  1 实验材料  17-22
    1.1 细胞株  17
    1.2 菌株  17
    1.3 质粒  17
    1.4 主要试剂  17-18
    1.5 主要实验器材  18-19
    1.6 实验中使用的缓冲液和试剂的配制  19-22
  2 实验方法  22-35
    2.1 shRNA 真核表达载体的设计和构建  22-24
    2.2 细胞培养  24-25
    2.3 真核表达载体转染细胞  25-26
    2.4 MTT 法检测细胞体外生长情况  26-27
    2.5 细胞形态学的改变  27
    2.6 流式细胞仪(FCM ) 分析细胞凋亡  27
    2.7 Westernblot 检测细胞中蛋白表达情况  27-29
    2.8 人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达检测  29-32
    2.9 TRAP-PCR 银染法检测端粒酶活性  32-34
    2.10 统计学分析  34-35
第二章实验结果  35-43
  1 PGENESIL-1-SP1 真核表达载体的鉴定  35-37
    1.1 pGenesil-1-Sp1 酶切结果  35
    1.2 基因测序结果  35-37
  2 PGENESIL-1-SP1 转染SW480 细胞及转染效率  37
  3 SP1 基因沉默对SW480 细胞形态学的影响  37-38
  4 MTT 实验结果  38-39
  5 流式细胞术(FCM)分析细胞的凋亡  39-40
  6 转染PGENESIL-1-SP1 后SP11 在大肠癌细胞中的蛋白表达  40-41
  7 SP1 沉默后对大肠癌细胞HTERT 表达的影响  41-42
  8 SP1 沉默后对大肠癌细胞端粒酶活性的影响  42-43
第三章讨论  43-47
第四章结论  47-48
参考文献  48-52
综述  52-60
  参考文献  57-60
个人简介  60-61
致谢  61

RNA干扰抑制Sp1对大肠癌SW480细胞端粒酶活性的影响

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