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PCR法评价泼尼松龙诱导弓形虫隐性感染小鼠的复发及阿奇霉素对复发的疗效

作　者: 陈凤鸿
导　师: 陈锡慰
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 弓形虫泼尼松龙阿奇霉素小鼠 PCR
分类号: R531.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界性分布、机会性细胞内寄生、人兽共患的原虫。当免疫系统正常的机体在感染弓形虫时,大多数感染者无症状或仅有发热、腹泻等非特异性症状,而在孕妇妊娠期感染弓形虫则可以引起流产、早产、死胎、畸形等严重后果。更为严重地是,在机体的免疫系统受到抑制或免疫缺陷者感染弓形虫时,甚至会危及生命。弓形虫感染后对宿主的损害与宿主的免疫状态密切相关,因此感染弓形虫后宿主免疫机制的引发了广泛的关注。一般认为机体抵抗弓形虫感染的细胞免疫机制十分复杂,其中,包括多种免疫细胞和免疫因子的参与及其相互作用,是人体抵抗弓形虫感染的主要保护性免疫,在抑制虫体繁殖、阻止包囊活化、清除虫体、控制虫血症等方面起重要作用。免疫功能正常的机体难以完全清除弓形虫,后者可以很快地以包囊的形式在组织里潜伏下来,这就是所谓隐性感染,即一种没有任何症状且常规检查不能查出病原体的感染状态。而一旦机体的免疫功能出现异常时,潜伏的包囊就会破裂继而出现弓形虫病复燃。近年来大量流行病调查显示肿瘤、自身免疫性疾病、AIDS、器官移植、肾炎等患者的弓形虫病发病率高于普通人群,这类人群弓形虫病发病率升高和获得性免疫功能异常两者之间有无联系以及其内在机制尚不清楚,这也是本研究的目的所在。获得性免疫功能障碍是指后天由于各种原因导致的免疫功能异常,其中医源性免疫功能异常是最常见原因,恰恰这类人群常规治疗的过程中都使用了激素。众所周知,激素在治疗疾病本身的情况下还会对机体免疫系统造成伤害,所以,研究激素与弓形虫隐性感染复燃之间的关系意义重大。目前,乙胺嘧啶和磺胺类药物是治疗弓形虫病的常规药物,但是乙胺嘧啶和磺胺类药物对骨髓造血的抑制作用,及对孕期妇女的副作用不详限制了其使用。阿奇霉素作为一种新的治疗弓形虫病的药物已经有若干年,它既没有骨髓造血抑制副作用也不会对孕期孕妇产生毒副作用,所以阿奇霉素作为治疗弓形虫病的前景广阔。但是,目前国内尚无统一的阿奇霉素作为治疗弓形虫病疗效考核标准。因此,本研究的治疗部分主要的目的是考察阿奇霉素治疗效果,为阿奇霉素治疗激素诱导的弓形虫复发的疗效考核标准提供理论依据。首先,我们通过参照既往方法纯化小鼠脑组织里的弓形虫包囊,并对其方法加以改良。其后,对比Lysis buffer法和DNA萃取试剂盒两种方法的优缺点,我们选出适合萃取弓形虫DNA的方法。然后,利用弓形虫B1基因和AF146527基因序列设计两对引物并对比两对引物的敏感性,确定使用何种目的基因引物。之后,建立了Prugniaud株弓形虫感染小鼠模型,利用在不同时间点PCR结果来确定小鼠感染后进入隐性感染状态的时间。最后,利用小鼠后肢内侧皮下注射盐酸泼尼松和腹腔注射阿奇霉素,通过PCR结果以及小鼠的死亡率和脑组织的包囊数量评价盐酸泼尼松龙诱导隐性弓形虫感染小鼠复发及阿奇霉素对复发的疗效。目的:建立Prugniaud株弓形虫感染小鼠模型,探讨盐酸泼尼松龙诱导隐性弓形虫复发及评价阿奇霉素对复发的疗效。方法:1、参照文献方法纯化包囊的方法,并加以改良,建立纯化弓形虫包囊的有效方法。2、采用腹腔注射包囊的感染方式,ICR杂交系小鼠在不同感染剂量10个包囊/只小鼠时对Prugniaud株弓形虫的易感性,观察小鼠感染后状态、生存期。3、采用B1基因和AF146527基因序列合成的两对引物比较其的敏感度差异,以确定采用何种引物。4、分别采用Lysis buffer法和DNA萃取试剂盒法萃取感染弓形虫急性期小鼠全血DNA。5、雌性ICR小鼠体重20 g左右,腹腔注射感染Prugniaud株弓形虫包囊每鼠10个,分别在0、1、2、3、4、5、6、7周采集各组小鼠采血,萃取全血DNA,通过PCR方法扩增弓形虫特异性基因。6、在感染后第5周,通过小鼠后肢内侧皮下注射盐酸泼尼松龙和腹腔注射阿奇霉素观察PCR结果统计小鼠的死亡率和脑组织内包囊数。结果:1、本次建立的纯化弓形虫包囊的方法纯化出的包囊镜下观察纯度较高,接种易感ICR小鼠可致小鼠短期内发病无死亡。2、ICR小鼠在每只小鼠感染10个包囊时均可较稳定地度过大约两周的急性感染期,且能存活。3、B1基因引物在弓形虫DNA含量为16 ng、1.6 ng、160 pg、16 pg、1.6 pg、0.16 pg时可以扩增出与预期目的片段长度一致的DNA片段,约226 bp,而AF146527基因在弓形虫DNA含量为16 ng、1.6 ng、160 pg、16 pg时可以扩增出与预期目的片段大小一致的DNA片段,约为249 bp,而1.6 pg和0.16 pg则扩不出相应片段。4、Lysis buffer方法萃取急性期感染弓形虫小鼠全血DNA中含有弓形虫DNA;而DNA萃取剂盒方法萃取急性期感染弓形虫小鼠全血DNA中不含有弓形虫DNA。5、感染Prugniaud株弓形虫的ICR小鼠在感染后3周萃取全血DNA,使用B1基因引物通过PCR方法可以100%检测出226bp大小的阳性条带,然而在感染后的第4周只能部分检测到阳性条带,在感染后第5周全血萃取DNA几乎检测不到阳性条带。6、使用泼尼松龙的第2周内,感染弓形虫小鼠均有死亡。其中经过治疗的小鼠其死亡率低于不治疗的死亡率(P<0.0005);注射盐酸泼尼松龙的感染弓形虫的小鼠脑组织里单位体积内的包囊数量多于治疗后的小鼠(P<0.01)。结论:1、通过对原有方法进行改良,可以成功分离制备小鼠脑组织匀浆弓形虫包囊。2、在ICR小鼠通过腹腔注射包囊方式可以稳定建立弓形虫感染小鼠模型,一般选择为10个包囊/只小鼠。3、通过比较B1基因和AF146527基因序列合成的两对引物的敏感度发现,B1基因更适合作为诊断弓形虫的目的基因。4、在萃取感染弓形虫小鼠急性期全血DNA方面,Lysis buffer方法比DNA萃取剂盒方法更适合。5、小鼠在感染弓形虫前5周通过PCR方法能够准确诊断弓形虫病;而在小鼠感染弓形虫5周后进入隐性感染状态,此时PCR方法不能诊断小鼠弓形虫感染。6、泼尼松龙能诱导隐性弓形虫感染小鼠的复发并导致小鼠的死亡;阿奇霉素对治疗弓形虫病有效,但不能完全治愈弓形虫病。

全文目录

中文摘要  4-8
Abstract  8-13
前言  13-17
材料和方法  17-24
结果  24-29
讨论  29-37
结语  37-40
参考文献  40-47
综述  47-66
  参考文献  58-66
附录  66-67
攻读学位期间发表的文章  67-68
致谢  68

PCR法评价泼尼松龙诱导弓形虫隐性感染小鼠的复发及阿奇霉素对复发的疗效

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