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中华绒鳌蟹cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达

作　者: 郭慧芝
导　师: 朱邦科；聂品
学　校: 华中农业大学
专　业: 渔业资源
关键词: 中华绒鳌蟹 cDNA文库 免疫相关基因 C型凝集素A C型凝集素B 铁蛋白 基因克隆 组织表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


中华绒螯蟹是我国具有重要经济价值的水产品。近年来,随着养殖规模的不断扩大及环境的恶化,各种由细菌、病毒和寄生虫等病原引起的疾病频繁发生,给中华绒螯蟹的养殖带来了巨大经济损失。本研究借助分子生物学手段,首先通过构建脂多糖刺激的中华绒螯蟹cDNA文库,在此基础上,筛选出一些与免疫相关的基因序列,并通过cDNA末端快速扩增(RACE)和实时荧光定量PCR技术进一步对主要免疫相关基因进行了克隆和表达分析,为中华绒螯蟹的免疫机制提供基础资料。结果如下：1.运用SMART技术成功构建了库容量为6.28×106,重组率为95.8%,平均插入片段为700 bp的脂多糖刺激的中华绒螯蟹cDNA文库,从文库中挑取cDNA克隆进行测序,总共进行了319个成功反应,获得140个包含重叠群的表达序列标签(EST),使用BLAST软件将这些序列同GenBank等数据库进行比对、查询和注释,结果显示121条序列有相关同源性,获得了一些会在中华绒螯蟹的免疫反应中起着重要作用基因的ESTs,为中华绒螯蟹免疫相关基因的深入研究奠定了基础。2.C型凝集素是一个具有糖识别结构域的超家族,在无脊椎动物的先天免疫系统中起重要作用。在前期构建中华绒螯蟹cDNA文库时获得的两个C型凝集素的EST序列的基础上,采用RACE方法扩增了这两个基因的cDNA序列。中华绒螯蟹C型凝集素A(EsLecA)其全长为772 bp,包含462 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为153 aa,其5’和3’端的非编码区分别为175 bp和135 bp；C型凝集素B(EsLecB)其全长为700 bp,包含504 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为167aa,其5’和3’端的非编码区分别为24 bp和172 bp。通过荧光定量PCR的方法研究了EsLecA和EsLecB基因在中华绒螯蟹的组织表达分布以及经脂多糖和PolyI：C刺激后在血淋巴、肠、鳃和肝胰腺组织中的表达变化,发现EsLecA和EsLecB基因主要在肝胰腺中表达。与对照组相比,肠、鳃和肝胰腺在脂多糖和Poly I:C免疫后EsLecA表达量均表现上调；与对照组相比,血淋巴、肠、鳃和肝胰腺在脂多糖和Poly I:C免疫后EsLecB表达量均表现上调。3.铁蛋白是普遍存在于生物体内,具有铁离子解毒和储存等功能的蛋白,在构建脂多糖刺激的中华绒螯蟹cDNA文库的基础上,获得了中华绒螯蟹铁蛋白基因EsFer的cDNA序列,其全长为1,118 bp,包含480 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为159 aa,其5’和3’端的非编码区分别为178 bp和461 bp,在15-37 aa处有一个跨膜螺旋。在5’非编码区核甘酸序列的135-162的位置有个特殊的结构,即铁反应元件。通过荧光定量PCR的方法研究了铁蛋白基因在中华绒螯蟹的组织表达分布以及经脂多糖刺激后在血淋巴、肠和肝胰腺组织中的表达变化,发现EsFer在中华绒螯蟹血淋巴、肌肉、肠、鳃、心脏、性腺、肝胰腺等组织器官中都有表达,在肝胰腺中的表达量最高,血淋巴中表达量最低。经脂多糖诱导后EsFer在血淋巴、肠和肝胰腺呈上调表达。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略词表  11-13
第一章 文献综述  13-22
  1 甲壳动物先天免疫系统的研究进展  13-18
    1.1 细胞免疫  13-15
      1.1.1 血细胞的分类  13
      1.1.2 血细胞的功能  13-15
    1.2 体液免疫  15-18
      1.2.1 凝集素  15-16
      1.2.2 抗菌肽  16
      1.2.3 酚氧化酶原激活系统  16-17
      1.2.4 溶酶体酶  17-18
  2 中华绒螯蟹免疫相关基因的研究概况  18-21
    2.1 酚氧化酶酶原  18-19
    2.2 丝氨酸蛋白酶抑制因子Pacifastin  19
    2.3 抗脂多糖因子  19
    2.4 硫氧还蛋白  19-20
    2.5 胸腺肽重复蛋白  20
    2.6 脂多糖和β-1,3葡聚糖结合蛋白  20-21
  3 本研究的目的与内容  21-22
第二章 中华绒螯蟹cDNA文库的构建及EST序列的初步分析  22-33
  1 前言  22
  2 材料与方法  22-26
    2.1 试验材料  22-24
      2.1.1 主要仪器  22-23
      2.1.2 试剂盒与主要试剂  23-24
      2.1.3 载体和菌株  24
      2.1.4 试验动物  24
    2.2 方法  24-26
      2.2.1 总RNA的提取及mRNA的纯化  24-25
      2.2.2 cDNA第一链、第二链的合成  25
      2.2.3 cDNA片段的分离  25
      2.2.4 cDNA与载体的连接与转化  25-26
      2.2.5 文库滴度及质量检测  26
      2.2.6 cDNA文库的筛选与测序  26
      2.2.7 EST测序结果分析  26
  3 结果  26-31
    3.1 总RNA的提取及mRNA的纯化  26-27
    3.2 cDNA的合成  27
    3.3 cDNA的分级分离与转化  27-28
    3.4 文库滴度及文库克隆的PCR检测  28
    3.5 EST测序结果初步分析  28-31
  4 讨论  31-33
第三章 中华绒螯蟹两种C型凝集素的克隆与表达  33-51
  1 前言  33
  2. 材料与方法  33-39
    2.1 试验动物  33-34
    2.2 RNA提取  34
    2.3 C型凝集素A(EsLecA)5'-RACE的扩增  34-35
      2.3.1 cDNA第一链的合成  34
      2.3.2 EsLecA cDNA片段的获得  34-35
    2.4 C型凝集素B(EsLecB)5'-RACE的扩增  35-36
    2.5 RACE产物的克隆和测序及全长cDNA的获得  36-37
    2.6 序列分析及系统进化树的构建  37
    2.7 EsLecA和EsLecB的组织表达分布及诱导性表达  37-39
      2.7.1 中华绒螯蟹的免疫刺激、RNA提取  37
      2.7.2 RNA样品中DNA的处理  37-38
      2.7.3 cDNA模板的制备  38
      2.7.4 实时荧光定量PCR  38-39
  3 结果  39-49
    3.1 EsLecA和EsLecB核酸序列及推导的氨基酸序列特征  39-42
      3.1.1 EsLecA核酸序列及推导的氨基酸序列特征  39-41
      3.1.2 EsLecB核酸序列及推导的氨基酸序列特征  41-42
    3.2 EsLecA和EsLecB的系统进化分析  42-44
    3.3 标准曲线的建立  44-45
    3.4 实时荧光定量PCR检测EsLecA和EsLecB的组织表达分布  45-47
    3.5 实时荧光定量PCR检测EsLecA和EsLecB的诱导表达变化  47-49
      3.5.1 EsLecA的诱导表达变化  47-48
      3.5.2 EsLecB的诱导表达变化  48-49
  4 讨论  49-51
第四章 中华绒螯蟹铁蛋白基因的克隆与表达  51-62
  1 前言  51-52
  2 材料与方法  52-53
    2.1 实验动物  52
    2.2 铁蛋白基因的序列分析及系统进化树的构建  52
    2.3 中华绒螯蟹的免疫刺激、RNA提取  52
    2.4 RNA样品中DNA的处理  52
    2.5 中华绒螯蟹铁蛋白基因的组织表达及诱导性表达  52-53
  3 结果  53-59
    3.1 铁蛋白基因EsFer核酸序列及推导的氨基酸序列特征  53-54
    3.2 铁蛋白基因EsFer的多序列比对以及系统进化树分析  54-57
    3.3 标准曲线的建立  57-58
    3.4 铁蛋白基因EsFer的组织表达分布及诱导性表达  58-59
  4 讨论  59-62
参考文献  62-74
附录  74-75
致谢  75

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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