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虾夷扇贝是20世纪80年代有日本引入我国,现已成为我国北方重要的贝类养殖品种,但近年来,虾夷扇贝陆续爆发大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,还严重影响了该产业的健康发展。病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求我们对此进行更加深入的研究。虾夷扇贝中抗病基因的克隆和表达无疑是研究养殖动物免疫防御机制,提高机体抗病力,实现遗传改良的基础和关键。为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5’端测序,比对,从虾夷扇贝肾脏文库中筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。该cDNA全长为1536bp,5’端非编码区84 bp, 3’端非编码区321 bp,编码区1131 bp,编码377个氨基酸;在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其他功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。从虾夷扇贝外套膜文库中筛选出G型溶菌酶同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到G型溶菌酶基因cDNA全长序列。该基因序列全长为731 bp,5’端非编码区25 bp, 3’端非编码区100 bp,编码区606 bp,编码202个氨基酸。经过进一步分段扩增、测序,得到该基因的五个内含子,将该基因分成六个外显子。六个外显子长度分别为55 bp,60 bp,90 bp,113 bp,148 bp和140 bp;五个内含子的长度分别为7087 bp,5178 bp,3526 bp,710 bp和1400 bp;内含子的两侧都具有RNA正确剪接所必需的识别位点(GT/AG)。采用实时定量PCR方法,检测了虾夷扇贝G型溶菌酶基因在不同组织中的表达以及在菌注射后不同时段G型溶菌酶基因在血细胞中的表达状况。结果发现,该基因主要在外套膜和肝胰腺中表达,在鳃、肾脏、闭壳肌和血细胞中也有微量的表达,在鳗弧菌刺激后的3小时、6小时、9小时三个时段中,G型溶菌酶在血中的表达均显著高于对照组,第12小时、24小时低于对照组,第36小时高于对照组。另外,本研究随机克隆了虾夷扇贝5个不同个体的G型溶菌酶编码区并测序,发现有3个有义突变,由于测序容易产生误差,又对这3个有义突变进行了高通量SNP基因型分析,结果显示有1个有义突变是准确的。为进一步研究其物种的遗传多态性和基因表达差异奠定了基础。
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