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引入二硫键提高黑曲霉XynⅢ热稳定性的研究

作　者: 卢雪丽
导　师: 刘亮伟
学　校: 河南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 木聚糖酶二硫键热稳定性重叠延伸 PCR 定点突变
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

木聚糖酶在造纸、饲料、食品以及能源等领域的应用价值已经得到了肯定,但由于纸浆处理通常是在高温条件下进行,在饲料制粒加工中也需要短暂的高温处理,很多天然的木聚糖酶热稳定性较差,成为它们在饲料、造纸行业中应用的瓶颈。因此,对木聚糖酶热稳定性的改良十分必要。本实验室筛选的黑曲霉A-25是一株木聚糖酶高产菌株,由它分泌的β-1,4-内切木聚糖酶属于G/11家族,最适反应温度为48℃,不适于在高温的生物工程环境下使用。本研究将黑曲霉A-25所分泌的XynⅢ基因序列(登录号为EU375728)与另外两种已经引入二硫键的的木聚糖酶序列(登录号分别为P55329和P36217)进行序列比对,并设计7对突变引物,分别将原蛋白序列的第30位、47位、128位、130位、174位、177位、178位的氨基酸替换为半胱氨酸,即(G30C;D47C;V128C ;S130C;N174C;N177C;F178C)。通过组合,用重叠延伸 PCR和常规PCR对野生酶基因进行定点双突变,获得四对突变基因即四对二硫键(G30C:D47C,S130C:N174C,S130C:N177C,V128C:F178C)。突变基因经过酶切、酶连、转化和电泳鉴定,突变基因确实克隆到表达载体pET20b上。将含有突变基因的重组质粒转化入大肠杆菌中诱导表达,获得具有木聚糖酶活性的蛋白。通过对重组酶的酶学性质进行研究发现:野生酶在50℃保温30min后残余酶活为18%左右,突变体酶S130C/N174C和V128C/F178C分别为70%和80%,其热稳定性较野生酶的提高了四倍左右;而S130C/N177C和G30C/D47C的热稳定性与野生酶相比有所降低,48℃保温30min后G30C/D47C的残余酶活仅为20%,50℃保温30min后几乎为零;S130C/N177C在48℃保温30min后酶就完全失活;S130C/N174C和V128C/F178C在50℃条件下的半失活时间有原来的12min分别提高到31min和25min。总体说来本研究成功地对黑曲霉木聚糖酶进行了改造,热稳定性有了一定程度的提高,木聚糖酶的酶学性质得到了改良。

全文目录

摘要  7-8
1 文献综述  8-19
  1.1 木聚糖酶的应用  8-10
    1.1.1 木聚糖酶在饲料工业中的应用  8-9
    1.1.2 木聚糖酶在造纸工业中的应用  9
    1.1.3 木聚糖酶在食品、酿酒工业中的应用  9
    1.1.4 木聚糖酶在能源方面及其他方面的应用  9-10
  1.2 木聚糖酶的分类和蛋白质结构  10-12
    1.2.1 木聚糖酶的分类  10
    1.2.2 木聚糖酶的蛋白质结构  10-12
  1.3 木聚糖酶的分子改造  12-16
    1.3.1 重叠延伸 PCR 法(over-1ap extension PCR，OE-PCR)  13-14
    1.3.2 DNA 改组（DNA Shuffling）技术  14
    1.3.3 交错延伸技术（stagger extension process,StEP）  14-15
    1.3.4 体外随机引发重组（random priming in vitro recombination,RPR）  15
    1.3.5 体外诱变技术的应用  15-16
  1.4 木聚糖酶的研究热点  16-19
    1.4.1 引入突变构建二硫桥  16-17
    1.4.2 改造信号肽  17
    1.4.3 融合表达  17
    1.4.4 定点突变  17-19
2 引言  19-20
3 材料与方法  20-29
  3.1 材料  20-22
    3.1.1 菌株和载体  20
    3.1.2 试剂与药品  20-21
    3.1.3 培养基  21
    3.1.4 仪器设备  21-22
  3.2 实验流程  22-23
  3.3 实验方法  23-29
    3.3.1 突变位点的确定  23
    3.3.2 设计突变引物  23-24
    3.3.3 质粒DNA 的制备  24
    3.3.4 二硫键突变体的获得  24-26
    3.3.5 各突变体质粒热击转化大肠杆菌BL21  26
    3.3.6 突变基因在大肠杆菌中的表达与检测  26-27
    3.3.7 表达产物的纯化  27
    3.3.8 重组木聚糖酶的酶学性质分析  27-29
4 结果与分析  29-36
  4.1 突变体基因的PCR 扩增  29-31
  4.2 携带双位点突变的重组质粒的鉴定  31-32
  4.3 突变基因的测序与序列比对  32-33
  4.4 突变基因在大肠杆菌中的诱导表达  33-34
    4.4.1 突变酶表达产物的检测  33
    4.4.2 突变酶表达产物的纯化  33-34
  4.5 突变体木聚糖酶的酶学性质  34-36
    4.5.1 酶反应最适温度  34
    4.5.2 酶的热稳定性  34-36
5 结论与讨论  36-39
  5.1 结论  36
  5.2 讨论  36-38
  5.3 后续工作  38-39
    5.3.1 突变体木聚糖酶二硫键的检测  38
    5.3.2 突变体木聚糖酶的二级结构分析  38
    5.3.3 进一步改造木聚糖酶的热稳定性  38
    5.3.4 进一步纯化蛋白进行三维结构的确定  38-39
参考文献  39-43
ABSTRACT  43-44
致谢  44-45
缩略语表  45

引入二硫键提高黑曲霉XynⅢ热稳定性的研究

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