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实时荧光定量PCR检测良性前列腺增生和前列腺癌组织中HER-2表达以及与Gleason评分的相关性分析

作　者: 黄亚强
导　师: 钟惟德
学　校: 南方医科大学
专　业: 泌尿外科
关键词: HER-2 前列腺增生症前列腺癌 FQ-RT-PCR
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究目的在我国老年男性人口中,前列腺癌和前列腺增生是常见疾病。当前临床诊断中使用前列腺特异抗原(PSA)作为前列腺癌和前列腺增生的主要鉴别诊断手段,用Gleason评分来进行前列腺癌病理分级。然而由于PSA并非前列腺癌细胞所特有。前列腺增生、前列腺炎,甚至乳腺癌等多种疾病亦会引起血浆中PSA升高。当PSA在4～10 ng/ml时,难以区分PCa和BPH。而进行Gleason评分时,受到病理医生的主观看法和经验的影响,也不可能对前列腺癌的恶性程度进行客观,准确的判定。因此临床有必要寻找比PSA更可靠的诊断指标,比Gleason评分更客观的病理分级指标。近几年的研究中,对肿瘤的研究发现HER-2/neu的异常表达是肿瘤形成的又一关键因素。HER-2/neu正常时许多分泌性上皮都有低水平的表达。HER—2/neu通过多种细胞内分子参与信号传导,初步认为HER-2/neu的过表达可以通过交叉激活(transactivation)AR而引起肿瘤。在人类癌症中,HER-2/neu的分子改变通常是正常基因产物的过度表达。由于HER—2/neu蛋白定位于浆膜,其扩散限制于双向,即使中等水平HER—2过度表达也能产生受体结上活化。免疫组化染色发现乳腺癌细胞的HER—2蛋白水平比邻近正常乳腺上皮高10～100倍。Craf等对患有雄激素依赖型前列腺癌的SCID雄小鼠进行阉割,就将原来雄激素依赖型LAPC-4模型衍生得到雄激素非依赖型前列腺癌,HER-2/neu蛋白表达水平随之升高2-25倍,而且有随着传代而HER-2/neu表达水平上升的趋势。在一些研究中发现HER-2/neu过表达在体外和在活体都有促进雄激素非依赖性生长的作用。以上事实证明HER-2/neu扩增及过度表达是引起前列腺癌症的重要因素。HER-2/neu蛋白的过度表达在前列腺癌的发生、发展中起重要作用,并可作为判断预后的一个指标。因此,本实验选用HER-2/neu作为靶基因具有充分的实验依据。HER-2/neu在细胞中的生理功能非常重要,涉及到细胞内信号转导、细胞周期的调控、细胞凋亡和肿瘤中血管的生成等。HER—2介导的胞内信号途径主要包括促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteikinase, MAPK)途径及磷酸肌醇-3激酶(phosphoinositide-kinase, PI-3K)/丝-苏氨酸激酶(AKT)途径。MAPK是HER—2及其他酪氨酸激酶受体激活的主要信号途径。HER—2介导的另一信号途径为在细胞存活中发挥重要作用的PI-3K/AKT途径。HER3受体具有结合PI-3K的基元(motif),而HER—2则缺乏此结合基元,但HER—2能诱导HER3磷酸化,使PI-3K结合于HER3,从而导致PI-3K/AKT激酶活化,并介导BAD和半胱天冬酶(caspase)-等靶分子磷酸化。AKT磷酸化并抑制糖原合成激酶3,使细胞周期蛋白D(cyclin D1)水平升高,驱动细胞进入细胞周期。AKT直接或间接作用的靶分子还包括Forkhead转录因子及Raf。最近的研究结果表明,HER-2/neu过表达可激活AKT及核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB),持续活化的AKT和NF-κB能导致抗凋亡级联反应,使癌细胞产生对TNFα的抗性,降低宿主对肿瘤的防御能力。HER—2的激活可以导致几条相对独立的途径的活化：如PLC-γ/PI3-K、STAT/JAK、Ras/MAPK、应激活化蛋白激酶、Src等,从而使即早基因fos和Jun的激活。而cyclinD1及p27可能是连接HER—2介导的有丝分裂与促进G1/S转化信号通路中的关键因素。HER—2激活后可通过Ras/MAPK和PI3-K/AKT途径上调cyclin D1,使p21稳定性降低,促进G1/S的转化及拮抗细胞的凋亡；而Herceptin可以下调cy-clinDl,并上调p27,抑制Cdk2活性,导致细胞周期的阻滞。上述实验结果说明HER-2有可能成为肿瘤治疗中重要的靶点,为肿瘤基因治疗指明了又一方向。本论文利用实时荧光定量PCR对良性前列腺增生和前列腺癌的组织中HER-2基因表达量进行定量检测。结合临床中良性前列腺增生的病理诊断和前列腺癌的Gleason评分,探讨HER-2基因在前列腺癌的诊断和病理分级中的意义,进一步认识HER-2的生物行为学特征。通过下调HER-2/neu基因在肿瘤细胞中的表达,来证实HER-2/neu在细胞的增殖、分化及抗凋亡方面的作用,为肿瘤的基因治疗提供一新的靶点。材料和方法收集广州医学院附属广州市第一人民医院泌尿外科2003年9月到2006年12月收治的75例符合入组标准的良性前列腺增生,前列腺癌和正常人的前列腺组织。运用实时荧光定量PCR测定标本中HER-2基因的表达量,并记录石蜡切片观测样本的病理诊断和Gleason评分。比较良性前列腺增生和前列腺癌HER-2表达值的不同,统计前列腺癌中HER-2与Gleason评分中的相关性。统计学处理计量资料两组样本均数比较使用t检验。计量资料与等级资料相关性分析使用Spearman等级相关分析。结果1、前列腺组织中HER-2基因表达值在BPH与PCa组织中有明显差异。(P<0.01)2、前列腺癌组织中HER-2基因表达值在不同的Gleason评分中有差异,与Gleason评分呈等级正相关(Rs=0.977,P<0.01),随Gleason评分值升高而升高。结论1、检测前列腺组织中HER-2基因表达值可作为鉴别BPH和PCa的指标。2、前列腺组织中HER-2基因表达值随着Gleason评分呈正相关,HER-2基因随着Gleason评分的增高而表达增强。3、检测前列腺组织中HER-2基因表达值可作为判断PCa恶性程度的指标。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-28
  1、当前前列腺癌的诊断  13-14
  2、HER-2/neu研究进展  14-20
  3、Gleason评分  20-22
  4、实时荧光定量PCR  22-25
  5、国内外研究应用现状  25-27
  6、本研究的目的和拟解决的问题  27-28
材料与方法  28-43
  1、组织来源和临床资料  28-29
  2、实验器材及方法  29-31
  3、所用引物查询和设计  31-32
  4、FQ-RT-PCR  32-33
  5、实验条件的优化  33
  6、标准曲线的制作  33-34
  7、数据处理——相对定量方法  34-35
  8、FQ-RT-PCR条件优化和标准曲线的制作  35-40
  9、前列腺癌样本Gleason评分  40-42
  10、统计学分析  42-43
结果  43-47
  1、各BPH样本中HER-2的Ct值  43-45
  2、各PCa样本中HER-2的Ct值  45-46
  3、前列腺组织中HER-2基因表达值在BPH与PCa组织中差异性比较  46
  4、HER-2基因表达值在前列腺癌中不同Gleason评分的差异性比较  46-47
讨论  47-56
  1、前列腺癌的发生机制  47-49
  2、HER在前列腺癌诊断中的作用  49-53
  3、本实验揭示的原理  53-56
结论  56-57
参考文献  57-64
中英文缩略词表  64-66
攻读学位期间主要成果  66-67
致谢  67-69
统计学证明  69

实时荧光定量PCR检测良性前列腺增生和前列腺癌组织中HER-2表达以及与Gleason评分的相关性分析

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