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HIV-1 Nef蛋白抑制前列腺癌细胞生长及其分子机制初探

作　者: 曹戌
导　师: 华立新
学　校: 南京医科大学
专　业: 泌尿外科
关键词: HIV-1 Nef 前列腺癌细胞细胞凋亡信号通路
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:初步探讨人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)编码的病毒复制负调控因子(Negative factor,Nef)对前列腺癌(prostate cancer)细胞生长繁殖的影响及其分子机制。方法:(1)根据GenBank登记的Nef基因核苷酸序列设计PCR引物,在其5′端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点;以含有Nef基因的pCINL质粒为模板,扩增Nef基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pCI-neo中。为了便于蛋白检测,在下游引物5′端引入Flag序列,构建重组真核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后瞬时转染前列腺癌细胞,用免疫印记(Western blot, WB)从蛋白水平检测Nef基因的表达情况。(2)运用MTT实验和流式细胞术(flow cytometroy,FCM)检测Nef对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响。(3)以WB和虫荧光素酶报告实验(Luciferase Reporter Assay)测定Nef对前列腺癌细胞中雄激素受体(Androgen Receptor, AR)表达水平以及前列腺特异性抗体(Prostate Special Antibody, PSA)启动子活性的影响。(4)用WB和ELISA实验初步研究Nef对前列腺癌细胞中PTEN/PI3K/Akt和NF-κB信号通路的作用。结果:(1)成功构建了含Nef基因的重组真核表达质粒,核酸序列分析显示,克隆的Nef基因序列全长651 bp,与GenBank中登记的Nef基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和WB都在Nef预期位置检测到特异性条带。(2)MTT实验和流式细胞术显示Nef在体外能够轻度抑制前列腺细胞的增殖,同时诱导其细胞凋亡。(3)WB和虫荧光素酶报告实验表明,Nef在体外可以特异性的下调前列腺癌细胞中的AR的表达水平以及PSA启动子的活性。(4)WB和ELISA检测显示Nef至少可以部分阻断前列腺癌细胞中PTEN/PI3K/Akt和NF-κB信号通路的活性。讨论:(1)HIV-1 Nef基因在前列腺癌细胞中得到了正确表达。(2)Nef蛋白至少可以轻度抑制前列腺癌细胞的增殖,同时诱导其凋亡。(3)Nef蛋白对AR表达水平以及PSA启动子的活性的下调作用,可能是Nef抑制前列腺癌细胞增殖的潜在机制。(4)Nef蛋白可能通过部分阻断PTEN/PI3K/Akt和NF-κB信号通路的活性,从而诱导其凋亡。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-11
第一部分重组质粒pNef的构建及其在前列腺癌细胞中的表达  11-22
  引言  11-12
  材料和方法  12-18
  结果  18-21
  讨论  21-22
第二部分 Nef蛋白诱导前列腺癌细胞凋亡及其分子机制初探  22-35
  引言  22-23
  材料和方法  23-26
  结果  26-32
  讨论  32-35
全文总结  35-36
参考文献  36-46
附录1 试剂  46-50
附录2 实验方法  50-55
附录3 攻读硕士学位期间公开发表的学术论文  55-56
综述  56-71
  参考文献  64-71
致谢  71

HIV-1 Nef蛋白抑制前列腺癌细胞生长及其分子机制初探

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