学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

量子点荧光标记技术在人舌鳞癌的荷瘤裸鼠模型组织及其临床组织中检测特定蛋白的应用研究

作　者: 黄宇华
导　师: 赵建江
学　校: 南方医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 量子点荧光探针舌癌Tca8113细胞 Bcl-2 p53 荷瘤模型免疫荧光
分类号: R739.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 117次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

近年来口腔癌的发病率在中国、美国、日本和德国等均有上升趋势,尤其是在年轻女性,估计全球每年新发病例30万例。虽然癌症治疗已经取得了许多重要进展,但20世纪60年代至今,口腔癌的死亡率基本保持不变,5年生存率徘徊在50%左右。目前对口腔癌的病因、诊断、治疗和预后的研究越来越受到人们的重视。随着肿瘤分子生物学研究的发展,揭示了恶性肿瘤的发生与多种癌基因激活、抑癌基因失活和细胞凋亡的调节紊乱有着密切关系,癌基因的激活和抑癌基因的失活参与了癌症发生发展过程的不同阶段。大量的研究都表明癌基因的表达水平和癌症的治疗效果和预后都有着密切关系,因此加强对癌基因的研究,对癌症的预防、诊断和治疗都有着极其重大的意义。而不同部分、不同表型及不同阶段的癌症、参与的癌基因有可能均不相同。因此针对不同癌症类型和时期开展癌基因表达研究都有着现实价值。口腔癌90%以上是鳞状细胞癌,其中舌部的鳞状细胞癌的发病率最高。舌鳞癌的发生与发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程。在细胞恶性转化过程中,抑癌基因p53和凋亡抑制基因Bcl-2起着重要作用。目前研究表明,细胞的凋亡在口腔癌发生发展过程中起着十分重要的作用。Bcl-2是细胞凋亡调控中最重要的基因之一。Bcl-2蛋白是该领域研究较多的凋亡相关蛋白,国内外学者证实Bcl-2等凋亡相关蛋白在口腔鳞癌中都有异常表达。P53抑癌基因是细胞抑癌基因中研究最广泛和深入的基因之一,p53基因的异常几乎存在于人类所有的肿瘤。因此对Bcl-2和p53的研究将有助于了解恶性肿瘤的发生发展过程。长期以来,有机荧光一直被用来标记生物大分子以研究各种蛋白质之间的相互作用及对细胞的功能的影响。但是由于有机荧光的一些缺点,例如激发光谱较窄,光稳定性差,荧光寿命短等,限制了其作为标记物在生物分子、细胞、体内生物成像研究中的应用。近年来半导体量子点(Quantum dot, QD)由于其独特的光学性质：激发波长的范围宽且连续分布,而发射波长的范围窄且对称分布,并且发光度强,有持久的光化学稳定性等使其在生物医学领域的分子、细胞及体内的成像,尤其在肿瘤学的生物成像技术研究中,前景非常广阔。本课题利用半导体量子点的光学优点作为一种荧光探针,用于检测人舌鳞癌荷瘤裸鼠组织中Bcl-2表达及其在不同阶段的表达含量变化,及用于检测人舌鳞癌的组织切片中Bcl-2与p53蛋白的表达。国内外目前还未见有量子点荧光探针应用于荷瘤裸鼠肿瘤组织检测Bcl-2蛋白及对其不同阶段肿瘤组织进行半定量分析的研究报道,同时也未见利用量子点荧光探针对人舌鳞癌组织检测Bcl-2、p53蛋白的报道。第一章量子点荧光探针在检测人舌鳞癌裸鼠移植瘤组织中Bcl-2的应用研究目的了解量子点荧光探针在裸鼠舌鳞癌移植瘤组织中应用的可行性及其研究价值。方法1.荷瘤动物模型及标本制作传代培养人舌鳞癌Tca8113细胞,接种于裸鼠背部皮下,观察肿瘤生长情况,待肿瘤长至约1.0cm3时处死裸鼠取出肿瘤组织,分成两部分,一部分用4%多聚甲醛固定,行石蜡包埋,另一部分制作冰冻切片。2.对石蜡包埋组织切片行HE染色,证实组织为裸鼠荷瘤组织。3.对石蜡包埋组织切片行免疫组织化学HRP-DAB染色,证实Bcl-2蛋白在移植瘤组织中的表达及定位。4.对石蜡包埋组织切片行量子点标记Bcl-2的免疫荧光染色,荧光显微镜下观察,并与免疫组织化学HRP-DAB染色证实的Bcl-2蛋白进行比较。5.对冰冻组织切片行量子点标记Bcl-2免疫荧光染色,荧光显微镜下观察,与石蜡包埋组织切片的荧光染色进行比较。结果1.HE染色结果显示光镜下组织由大量瘤细胞组成,瘤细胞排列紧密,间质较少。瘤细胞呈大小不均的圆形,核浆比例大,异型性明显,核椭圆形、圆形、大小不等,核染色深,核分裂相多见。可见病理核分裂。染色质较粗、深染,核仁多个,可见瘤巨细胞。说明裸鼠移植人舌癌Tca8113肿瘤成功。2.免疫组织化学HRP-DAB染色显示,肿瘤细胞中Bcl-2蛋白表达呈阳性,棕褐色的颗粒主要位于肿瘤细胞胞浆。3.在石蜡包埋组织切片中用量子点荧光探针标记Bcl-2蛋白的免疫荧光染色显示,量子点与Bcl-2蛋白结合,定位于肿瘤细胞胞浆,在紫外光激发下,发出特异的红色荧光,Bcl-2蛋白定位与免疫组织化学HRP-DAB染色定位相同。空白对照未见明显特异红色荧光。4.在冰冻切片中用量子点荧光探针标记Bcl-2蛋白的免疫荧光染色显示,量子点与Bcl-2结合定位于肿瘤细胞胞浆,发出红色荧光,与石蜡包埋组织切片中的Bcl-2蛋白定位相同,但其荧光强度较大,亮度较高。第二章量子点荧光探针在检测不同阶段人舌鳞癌裸鼠移植瘤组织中Bcl-2改变的应用研究目的了解量子点荧光探针在人舌癌裸鼠移植瘤组织中定量检测特定蛋白的应用价值方法1.荷瘤动物模型及标本制作传代培养人舌鳞癌Tca8113细胞,按每只裸鼠1×107个细胞接种20只裸鼠背部皮下,观察成瘤情况,2只中途意外死亡。18只裸鼠成瘤后分别于接种后第5天、10天、15天、20天、25天、40天各处死3只裸鼠,记录肿瘤体积大小。取瘤组织后4%多聚甲醛固定,制成石蜡包埋组织,分别标记为A、B、C、D、E、F组,共18个石蜡包埋组织。每个石蜡包埋组织块均连续切片3张,厚度为4μm。2.分别对18个石蜡包埋组织中的一张切片行HE染色,以证实组织为裸鼠荷瘤组织。3.在相同实验条件下对18个石蜡包埋组织的切片分别行量子点荧光探针检测Bcl-2蛋白的免疫荧光染色,并在激光共聚焦下以相同拍摄条件对每张切片拍摄5张无重复视野的荧光成像图,用IPP专业图像分析软件对图像进行荧光强度分析。4.在相同实验条件下对18个石蜡包埋组织的切片分别行检测Bcl-2蛋白的免疫组织化学HRP-DAB染色,在相同拍摄条件下对每张切片拍摄5张无重复视野的组织成像图,用IPP专业图像分析软件对HRP-DAB染色图像进行对应的光密度分析。5.应用spss13.0软件对数据进行统计分析,将两者分析结果制作趋势图,分析两者的趋势。结果1.常规HE染色中：光镜下组织由大量瘤细胞组成,瘤细胞排列紧密,间质较少,瘤细胞呈大小不均的圆形,核浆比例大,异型性明显,核椭圆形、圆形、大小不等,核染色深,核分裂相多见。可见病理核分裂。染色质较粗、深染,核仁多个,可见瘤巨细胞。说明裸鼠移植人舌癌Tca8113细胞成功。2.用IPP专业图像分析软件对拍摄的量子点荧光探针检测Bcl-2的荧光图像的平均荧光强度进行分析,用spss13.0软件对图像分析结果作统计学分析,结果示荧光强度在第5天与第10天差别无统计学意义,第10天与第15天的差别有统计学意义,第15天与第20天的差别无统计学意义,第20天与25天的差别无统计学意义,第25天与第40天的差别无统计学意义,但第15天与第25天差别有统计学意义,第20天与第40天,第15天与第40天的差别有统计学意义。说明Bcl-2蛋白在裸鼠体内约在接种后第15天左右达到最高峰,然后缓慢下降。3.用IPP专业图像分析软件对拍摄的免疫组织化学检测Bcl-2蛋白的HRP-DAB染色图片的光密度进行分析,用spss13.0软件对图像结果作统计学分析。结果显示,第5天与第10天差别无统计学意义,第10天与第15天差别有统计学意义,第15天与第20天的差别无统计学意义,第20天与25天的差别无统计学意义,第25天与第40天的差别无统计学意义,但第15天与第25天差别有统计学意义,第15天与第40天差别有统计学意义。4.结果说明HRP-DAB染色的光密度代表的Bcl-2蛋白改变随时间变化趋势与量子点荧光强度代表的Bcl-2蛋白改变随时间变化趋势大致相同,Bcl-2蛋白在第15天达到高峰,后逐渐下降。第三章量子点荧光探针在人舌鳞状细胞癌组织中的应用研究目的研究量子点作为荧光探针在人的舌鳞状细胞癌组织中检测特定蛋白可行性及其优缺点,了解其临床的运用价值。方法1.标本来源：选取10例经病理确认的人舌鳞状细胞癌组织标本。2.切片制作：对选取的舌鳞状细胞癌组织标本,行常规石蜡包埋组织切片。3.用同一粒径量子点(QD605)分别对人舌鳞状细胞癌石蜡包埋组织切片中p53和Bcl-2蛋白进行标记,并在紫外荧光显微镜下观察。4.用不同粒径量子点(QD605和QD545)分别对人舌鳞状细胞癌石蜡包埋组织中p53和Bcl-2蛋白进行同时标记,并在紫外荧光显微镜下观察。结果1.用同一粒径量子点(QD605)分别对人舌鳞状细胞癌石蜡包埋组织中的p53和Bcl-2蛋白进行标记时,可以看到量子点(QD605)标记的p53蛋白,蛋白主要定位于细胞核,在紫外光激发下发出红色荧光；量子点(QD605)标记的Bcl-2蛋白,蛋白主要定位于细胞浆,在紫外荧光激发下发出特异的红色荧光；而空白对照则没有量子点激发出来的特异红色荧光。2.用不同粒径量子点(QD605和QD545)同时对人舌鳞状细胞癌石蜡包埋组织中的p53和Bcl-2蛋白标记时,可以看到量子点QD605标记的p53蛋白,蛋白主要定位于细胞核,在紫外光激发下发出红色荧光；而量子点QD545标记的Bcl-2蛋白,蛋白主要定位于细胞浆,在紫外光激发下发出绿色荧光,形成鲜明对比。全文结论：1.量子点荧光探针能在裸鼠荷瘤模型组织中对特异蛋白进行标记。2.量子点荧光探针可对裸鼠荷瘤模型组织内蛋白进行定量变化趋势分析。3.量子点荧光探针能在人舌鳞癌组织切片对特异蛋白进行标记。4.量子点荧光探针能在人舌鳞癌组织切片对多重蛋白进行特异标记。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-17
前言  17-20
第一章量子点荧光探针在检测人舌鳞癌裸鼠移植瘤组织中Bcl-2的应用研究  20-28
  1 材料和方法  20-24
  2 结果  24-26
  3 讨论  26-28
第二章量子点荧光探针在检测不同阶段人舌鳞癌裸鼠移植瘤组织中Bcl-2改变的应用研究  28-41
  1 材料和方法  28-29
  2 结果  29-37
  3 讨论  37-41
第三章量子点荧光探针在人舌鳞状细胞癌组织中的应用研究  41-52
  1 材料和方法  41-44
  2 结果  44-48
  3 讨论  48-52
全文总结  52-53
参考文献  53-58
中英文缩略词表  58-59
成果  59-60
致谢  60-62
统计学证明  62-63

量子点荧光标记技术在人舌鳞癌的荷瘤裸鼠模型组织及其临床组织中检测特定蛋白的应用研究

内容摘要

全文目录

相似论文