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非编码基因MALAT1调控结直肠癌转移的机制研究

作　者: 杨敏慧
导　师: 李祖国
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理与病理生理学
关键词: MALAT1 结直肠癌转移靶基因 RNA interference RNA activation 实时荧光定量PCR 蛋白质组学生物信息学预测 APAK-9
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着基因组计划的完成,以及蛋白质组学和转录组学的蓬勃开展,促使RNA组学研究日趋成熟,人类基因组的非编码组分非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)在生命过程中所发挥的不可忽视的重要作用已经逐步的到了广泛的重视和认可。通常,基因组研究集中在对基因组序列中开放读码框的注释和功能划定,然而在真核细胞中,仅有一小部分组分是基因组编码蛋白质的氨基酸序列信息,未知功能的非编码序列占人类基因组的98%,在调节基因表达中起着极为重要的作用。ncRNA被认为,在所有真核细胞调节中起着关键作用,可能具有参与转录调控、DNA复制、染色体配对和染色体凝集等作用。目前研究新获得的数据显示,有一大类功能性RNA分子或隐藏在蛋白质编码区之间或位于编码蛋白质区内,其功能有待进一步阐明。我们在结直肠癌特异性转移相关基因分析研究中,通过对来源同一亲本具有不同转移潜能结直肠癌细胞系进行表达谱芯片分析,发现在上调表达的298个基因,其中一个基因就是命名为MALAT 1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1, MALAT 1)为非编码RNA基因,属于长非编码RNA类(long noncoding RNA, lncRNA),定位于染色体11q13.1,全长8.7kb,缺乏明确的开放式阅读框,不编码蛋白质。MALAT 1在不同转移能力的结直肠癌细胞系中差异表达,我们推测MALAT 1可能具有对结直肠癌转移相关基因的调控作用,与结直肠癌的转移相关。为证实我们的假说,本次研究采用原位杂交技术和realtime-PCR检测结直肠癌恶性肿瘤组织、肿瘤转移组织和正常组织,以及9种人结直肠癌细胞株的MALAT 1表达情况,分析MALAT 1与结直肠癌中的表达及其与肿瘤转移性之间的关系；利用RNA沉默技术(RNA interference, RNAi)和RNA激活技术(RNA activation, RNAa)研究MALAT 1基因在结直肠癌增殖、侵袭、转移中的作用,探讨MALAT 1基因表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响；最后,利用生物信息学计算方法和蛋白质组学技术,筛查不同转移潜能结直肠癌细胞株的差异表达蛋白,分析鉴定非编码RNA基因MALAT 1调控结直肠癌转移相关基因靶点。第一部分MALAT 1在结直肠癌组织和细胞中的表达通过原位杂交技术,RT-PCR和realtime-PCR技术分别检测结直肠癌组织、转移癌组织和正常组织以及9种人结直肠癌细胞株MALAT 1的表达情况。在细胞水平：RT-PCR产物电泳图灰度分析显示：低转移潜能大肠癌细胞组MALAT1平均灰度值低于高转移潜能大肠癌细胞组,差异显著(t=-8.514,P<0.001),各细胞株组间灰度值具有显著差异(F=106.751, P<0.001);LSD检验结果显示：与Caco-2细胞相比,COLO-205、LoVo和SW620细胞MALAT 1表达量较高,SW480/M5、HT29和HCT1 16中等量表达,SW480表达量较低差异显著(P<0.05)；LS174 T细胞株表达量最低。realtime-PCR检测结果显示：结直肠癌高转移潜能细胞株MALAT 1表达量高于低转移潜能细胞株,差异显著(t=-7.189,P<0.001),结直肠癌细胞间MALAT 1基因表达差异显著(F=1045.526P<0.01);Dunnett T3检验结果显示：与大肠癌低转移潜能细胞株LS174 T相比,MALAT 1在COLO 205、LOVO、SW620和SW480／M5表达量较高(P<0.05); HT29、SW480和HCT116中表达量较低;原位杂交结果显示：高转移潜能细胞株的阳性评分高于低转移潜能细胞组,差异显著(χ2=8.586,P<0.05),MALAT 1阳性信号定位于结直肠癌细胞核,各细胞组间统计分析差异显著(χ2=11.913,P=0.036),与LS174 T细胞相比,高转移潜能细胞株SW620和LoVo中MALAT 1表达量较高,差异显著(P<0.05)。三种方法检测结果较为一致：高转移潜能细胞株中,MALAT 1表达量明显高于低转移潜能细胞株,其中以COLO 205和LoVo细胞MALAT 1表达量最高,而SW480和LS174 T表达量最低。在组织水平：RT-PCR产物电泳图灰度分析结果显示：结直肠癌组织中MALAT 1基因表达间差异显著(F=99.784,P<0.001)；其中淋巴结转移癌和结直肠癌组织中MALAT 1表达量高于正常大肠黏膜组织,有显著差异(P<0.01)；进行realtime-PCR反应结果显示：结直肠癌组织中MALAT 1基因表达组间差异显著(F=182.138,P<0.001)；其中淋巴转移癌中MALAT 1表达量最高,结直肠癌组织中表达量次高,正常组织表达量最低,差异显著(P<0.01)。RT-PCR和realtime-PCR检测结果一致：与正常黏膜相比,淋巴转移癌中MALAT1表达量最高,在结直肠癌组织中表达量较高,提示MALAT 1在大肠癌组织中的表达量与癌转移密切相关。分析细胞水平和组织水平MALAT 1表达量结果显示：非编码RNA基因MALAT 1在转移性较高的大肠癌细胞及组织中表达明显高于无转移性或低转移性大肠癌细胞和组织,MALAT 1表达水平与结直肠癌转移呈正相关。第二部分MALAT 1的表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响设计并构建MALAT 1基因干扰(RNA interference, RNAi)载体和基因激活(RNA activation, RNAa)载体,转染结直肠癌细胞株。荧光定量PCR检测MALAT1基因变化情况,观测MALAT 1基因水平上调或下调后结直肠癌细胞生物学行为的相应变化。结果：RNAa载体转染结直肠癌细胞后,荧光显微镜测定转染效率70%左右,realtime-PCR检测MALAT 1表达激活效率：与SW620细胞相比,RNAa处理后细胞MALAT 1表达显著升高(F=177.972,P<0.001),其中SW620-Promoter-dsRNA载体转染细胞上调2.687±0.114倍、SW620-pro-Cpg-dsRNA载体转染细胞上调3.172±0.118倍,差异显著(P<0.01)。MTT法观察MALAT 1表达上调后细胞体外的增殖能力显著提高(F=1153.007,P<0.001)。克隆形成实验结果显示：MALAT 1表达量上调后细胞平均克隆形成率升高,差异显著(F=157.083,P<0.001)。细胞体外侵袭实验检测MALAT1基因表达上调后细胞侵袭能力明显增强,细胞穿膜数明显高于SW620细胞组(F=58.286, P<0.001); RNAi处理后细胞MALAT 1表达下调0.271±0.024倍,差异显著(F=1701.135, P<0.001); MALAT 1表达下调后,细胞体外增殖能力下降,差异显著(F=313.421,P<0.001),细胞克隆形成率相应下降(t=44.472,P<0.001),细胞体外侵袭能力下降(F=212.160,P<0.001)。此外,我们还构建了MALAT1核心功能序列(MALAT1-functional gene’s fragment, MALAT 1-fgf)表达载体,以观察MALAT 1序列是否存在“核心功能区域”,结果显示：载体转染后,MALAT 1/fgf片段表达上调(F=200.093,P<0.001),序列其他部分表达不变(F=1.674,P=0.264)；与SW620细胞相比,细胞体外增殖能力无显著变化(F=0.892,P=0.452),细胞克隆形成率无显著变化(F=0.307,P=0.820),细胞体外侵袭能力无显著变化(F=4.257,P=0.071)。提示与RNAa处理后不同,MALAT 1部分序列表达上调,对细胞生物学行为无影响。此次试验研究中,成功的完成MALAT 1基因的体外RNA激活表达试验。设计可与MALAT 1启动子样区域特异性结合的dsRNA,转染细胞,提取总RNA,荧光定量PCR和原位杂交鉴定,证实MALAT 1表达上调,实现了MALAT 1的基因激活。MALAT 1激活后,细胞的体外增殖、侵袭能力大大提升。同时,当MALAT 1结构不完整时,未发现细胞的体外生长、增殖、侵袭能力变化,推测唯有当MALAT 1结构完整时才能引起结直肠癌细胞生物学行为发生改变。第三部分蛋白质组学联合生物信息学鉴定MALAT-1调控的靶基因SW620细胞和SW620-MALAT 1-dsRNA1细胞蛋白质2D图谱通过ImageMaster5.0软件分析和人工确认,共发现15个差异表达蛋白点,其中6个蛋白质点均经串联质谱成功鉴定。与SW620细胞相比,SW620-MALAT 1-dsRNA1载体转染细胞蛋白质图谱中3个点表达上调,3个点表达下调。HCT 116细胞、HCT-MALAT 1/fgf-5235载体转染细胞和HCT-MALAT1-RNAi载体转染细胞差异表达的蛋白质谱图比对,发现HCT 116细胞和HCT-MALAT 1/fgf-5235载体转染细胞蛋白质谱图差异甚微,而HCT-MALAT 1-RNAi细胞蛋白质谱图与二者均有明显差异,经过分析和鉴定,发现HCT-MALAT 1-RNAi细胞中存在2个表达量明显下调的蛋白质点根据蛋白质。通过生物信息学分析方法得到47个MALAT 1潜在靶标蛋白,筛选得到的差异蛋白绝大部分蛋白都与肿肿瘤恶性转化和转移等行为相关,涉及肿瘤细胞生长、运动、粘附、凋亡等过程,研究结果为阐明结直肠癌发生、发展的机制及肿瘤早期诊断、寻找预测结直肠癌转移的潜在标志物提供了理论依据。结合蛋白质组学质谱分析结果,我们发现在差异表达的蛋白质点APAK-9,存在于生物信息学预测潜在靶标范围中。因此,我们认为APAK-9是一种被MALAT-1调控的靶基因。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-19
第一章 MALAT 1在人结直肠癌组织和结直肠癌细胞系中的表达  19-43
  第一节 MALAT 1在人结直肠癌细胞系中的表达  19-31
    一、材料与方法  19-25
    二、结果  25-31
  第二节 MALAT-1在结直肠癌临床组织标本中的表达  31-36
    一、材料与方法  31-33
    二、结果  33-36
  讨论  36-38
  参考文献  38-43
第二章 MALAT 1的表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响  43-88
  第一节通过小dsRNA上调MALAT 1mRNA表达水平,观测对结直肠癌细胞SW620生物学行为的影响  43-63
    一、材料与方法  43-49
    二、结果  49-63
  第二节 RNAi下调MALAT 1 mRNA表达水平观测对结直肠癌细胞SW620生物学行为的影响  63-70
    一、材料与方法  63-64
    二、结果  64-70
  第三节过表达MALAT 1部分片段对SW620细胞生物学行为的影响 #55材料与方法  70-83
    一材料与方法  70-73
    二、结果  73-83
  讨论  83-85
  参考文献  85-88
第三章 MALAT 1调控结直肠癌转移相关基因的分析和鉴定  88-130
  第一节双向凝胶电泳技术分析MALAT 1调控的大肠癌转移相关差异表达蛋白  88-109
    一、材料与方法  88-99
    二、结果  99-109
  第二节生物信息学方法分析MALAT-1潜在调控靶标并比对其与2D差异蛋白是否有交集确立MALAT 1调控的靶基因  109-115
    一、材料与方法  109-110
    二、结果  110-115
  讨论  115-123
  参考文献  123-130
全文小结  130-131
英文缩略语对照表  131-132
攻读硕士学位期间发表的文章  132-133
致谢  133-135
统计学审稿证明  135

非编码基因MALAT1调控结直肠癌转移的机制研究

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