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四川地区鸭肝炎病毒流行病学调查

作　者: 吴睿雪
导　师: 彭广能
学　校: 四川农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 鸭肝炎病毒分离鉴定 VP1基因变异分析
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

为更好了解四川地区鸭肝炎病毒流行情况,本研究以从四川地区采集到8份疑似鸭病毒性肝炎病料为材料,开展了病毒的分离鉴定、VP1基因的克隆测序、序列变异分析等几个方面的研究。1.通过鸡胚尿囊腔接种分离病毒,得到2个病毒分离株,命名为ZJD和ZJM。所分离毒株在48h～84h即可100%引起9日龄鸡胚死亡。死亡鸡胚发育不良,水肿,全身出血,尤其是胚体头部及脚爪。剖检见肝脏充血出血。尿囊液变绿或变黄。对分离毒株经动物回归试验以及鸡胚半数致死量试验测定其致病性,结果发现,分离毒株对1日龄雏鸭致死率均为60%,发病雏鸭自发病起最快可于十几分钟内死亡。死后呈典型角弓反张姿势。解剖后可见主要病变器官是肝脏。肝脏普遍肿胀,边缘钝圆,病变主要为充血、出血,颜色变淡或略带土黄色,表面斑驳,有针尖大小、瘀斑状或弥漫性出血。多数胆囊肿胀,内充满墨绿色胆汁。部分死亡雏鸭肾脏肿大,血管树枝状充血。其余脏器无病变或不明显。ZJD株第5代尿囊液ELD50为10-4.764/0.2ml,ZJM株第5代尿囊液ELD50为10-4.60/0.2ml。分离毒株血凝试验均为阴性。2.参考GenBank中收录的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列,利用Primer Premier 5.0、oligo 6.0软件在保守区域设计一对引物,此引物扩增片段包含有VP1结构蛋白全基因组。通过优化反应条件建立RT-PCR检测方法,该方法能从分离毒株中扩增到长度为1341bp的目的片断。通过建立的RT-PCR方法鉴定其余6株未能从尿囊液中分离到毒株的尿囊液,另检测得到一个毒株,命名为NX。对所得到的3个毒株测序后进行遗传进化分析。结果表明,分离毒株与GenBank上已发表的DHVⅠ毒株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为91.0%～99.4%和94.5%～99.2%,证实分离毒株均为Ⅰ型鸭肝炎病毒。分离毒株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为93.7%～96.2%和96.6%～97.9%。经核苷酸同源性分析可知,分离株ZJD与ZZ株同源性最高,为99.4%,与LY0801同源性最低,为93.1%。NX与NA株同源性最高,为96.6%,与5886株同源性最低,为92.2%。ZJM与NA株同源性最高,为99.3%,与5886株同源性最低,为91.0%。由氨基酸同源性分析可知,分离株ZJD与ZZ株、X株以及GFS99株同源性最高,均为99。2%,与A66同源性最低,为94.5%。NX与NA株同源性最高,为97.9%与ZJ株同源性最低,为95.0%。ZJM与NA株同源性最高,为99.2%,与ZJ株同源性最低,为95.0%。基于VP1全基因核苷酸序列及氨基酸序列分别建立遗传进化树谱。结果表明,ZJD株的VP1基因与山东地区的SG株、ZZ株的VP1基因的核苷酸处于一个较小分枝上,亲缘关系最近；NX株与ZJM株的VP1基因处于同一分枝上,且均与福建地区的NA株的VP1基因处于同一较小分枝上,亲缘关系最近。而ZJD株的VP1基因与161-79-V的氨基酸序列处于较小分枝上；NX株与ZJM株的VP1基因氨基酸序列处于同一分枝上,且均与福建地区的NA株的VP1基因处于同一较小分枝上,亲缘关系最近。氨基酸序列与核苷酸序列的遗传进化方面略有些差别。本研究成功获得了3个毒株,并通过动物回归试验及胚半数致死量试验,表明分离到的毒株对雏鸭有较强致病力。同时对分离毒株VP1基因进行序列比较,发现分离毒株与参考毒株之间同源性较高,表明VP1基因较为保守,目前四川地区鸭肝炎病毒变异程度不大。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-14
第一章文献综述  14-29
  1 鸭病毒性肝炎的历史与分布  14-15
    1.1 Ⅰ型鸭肝炎病毒的历史与分布  14
    1.2 Ⅱ型鸭肝炎病毒的历史与分布  14
    1.3 Ⅲ型鸭肝炎病毒的历史与分布  14
    1.4 新型鸭肝炎病毒的历史与分布  14-15
    1.5 鸭肝炎病毒的变异性  15
  2 病原学  15-16
    2.1 分类地位及形态结构  15
    2.2 鸭肝炎病毒的培养特性  15-16
    2.3 鸭肝炎病毒的生物学特  16
    2.4 鸭肝炎病毒的理化特性  16
  3 流行病学  16-17
  4 发病机理  17
  5 临床症状  17
  6 病理变化  17-18
  7 诊断  18-24
    7.1 电镜检测  18
    7.2 血清保护实验  18-19
    7.3 中和试验  19
    7.4 琼脂扩散试验  19-20
    7.5 血凝试验  20-21
    7.6 荧光抗体法  21
    7.7 酶联免疫吸附试验  21-23
      7.7.1 间接ELISA  22
      7.7.2 斑点ELISA  22-23
      7.7.3 双抗夹心ELISA  23
      7.7.4 单克隆抗体捕捉法ELISA  23
    7.8 其他方法  23-24
  8 分子生物学研究基础  24-25
  9 PCR技术的研究进展  25-26
    9.1 PCR技术的基本原理  26
    9.2 逆转录PCR  26
  10 RT-PCR技术在鸭肝炎病毒中的应用  26-28
  11 研究意义  28-29
第二章四川地区鸭肝炎病毒分离及鉴定  29-38
  1 材料  29
    1.1 病料  29
    1.2 实验动物及鸡胚  29
    1.3 试剂  29
    1.4 主要仪器  29
  2 方法  29-32
    2.1 病毒分离  30
      2.1.1 样品与处理  30
      2.1.2 病毒的分离  30
    2.2 病毒鉴定  30-32
      2.2.1 动物回归试验  30-31
      2.2.2 鸭肝炎病毒分离株的毒力测定  31
      2.2.3 分离毒血凝性测定  31
      2.2.4 RT-PCR鉴定  31-32
  3 试验结果  32-35
    3.1 鸡胚接种  32
    3.2 动物回归试验结果  32-33
    3.3 鸭肝炎病毒分离株的毒力测定  33-34
    3.4 分离毒血凝性测定  34-35
    3.5 RT-PCR鉴定  35
      3.5.1 目的片断的扩增  35
      3.5.2 目的片段序列测定结果分析  35
  4 讨论  35-38
    4.1 病毒分离途径的选择  35-36
    4.2 病毒的分离  36
    4.3 病毒致病性研究及病理变化研究  36
    4.4 扩增产物  36-37
    4.5 RT-PCR检测  37-38
第三章鸭肝炎病毒结构基因VP1的克隆及序列分析  38-58
  1 材料  38
    1.1 毒株  38
    1.2 试剂  38
    1.3 主要仪器  38
  2 方法  38-40
    2.1 PCR扩增试验及序列测序  38-40
      2.1.1 引物设计  38-39
      2.1.2 样品RNA的提取  39
      2.1.3 RT-PCR  39-40
      2.1.4 RT-PCR产物鉴定  40
      2.1.5 基因序列的测定  40
  3 实验结果  40-56
    3.1 目的片断序列测定结果  40-44
    3.2 VP1基因序列分析  44-56
      3.2.1 核苷酸序列同源性分析  44
      3.2.2 核苷酸变异位点分析  44-50
      3.2.3 氨基酸序列同源性分析  50-51
      3.2.4 氨基酸变异位点分析  51-52
      3.2.5 抗原指数分析  52-54
      3.2.6 DHV遗传进化分析  54-56
  4 讨论  56-58
    4.1 Ⅰ型DHV VP1基因的克隆及测序分析  56
    4.2 结构蛋白VP1的抗原性  56-57
    4.3 DHV基因的研究前景  57-58
第四章全文结论  58-59
参考文献  59-67
附录一:版图  67-69
附录二:序列分析用到的毒株基本情况  69-70
附录三:主要溶液配制方法  70-71
致谢  71

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