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抗生素iso-migrastatin发酵条件优化和高产机理研究

作　者: 吴雪云
导　师: 徐志南；张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 异源生物合成 发酵条件优化 假想前体 荧光定量RT-PCR
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 38次
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内容摘要


Iso-Migrastatin (iso-MGS)是从S. platensis NRRL18993发酵液中分离得到的12元环的大环内脂类抗生素,具有抑制肿瘤细胞转移的生物学活性。利用基因工程技术,将携带有完整iso-MGS基因簇的载体pBS11001整合到五种不同模式菌株的染色体上,成功构建五种生物合成iso-MGS的工程菌株。本论文开展了iso-MGS工程菌的发酵培养条件优化的工作,通过培养基优化,五种工程菌异源生物合成iso-MGS的能力均得到提高,iso-MGS的产量提高了3-18倍不等,通过对比可以看出工程菌SB11001合成iso-MGS的能力明显高于其余四种工程菌,最高产量为128.6 mg/L,该菌也成为进一步组合生物合成iso-MGS的首选的工程菌。通过组合不同培养基之间的成分摸索出更适宜iso-MGS合成的培养基,摸索出一种组合B2培养基,使iso-MGS的产量进一步提高到186.7 mg/L,同时为异源生物合成其他天然产物所需培养基提供了借鉴。根据文献中报道的iso-MGS的假想生物合成路径,本实验验证了添加假想前体碳酸氢钠对iso-MGS产量的影响,添加2 g/L碳酸氢钠使iso-MGS的产量继续提高到207.8 mg/L。利用实时荧光定量RT-PCR技术研究野生菌和工程菌的mgs基因簇中每个基因在不同时期的表达丰度,从而发现与iso-MGS产量密切相关的基因,为进一步组合生物合成iso-MGS选择靶基因提供了理论基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章 文献综述  8-22
  1.1 抗生素iso-migrastatin 的研究进展  8-10
    1.1.1 iso-migrastatin 的分子结构  8-9
    1.1.2 Migrastatin 的理化性质  9
    1.1.3 iso-migrastatin 的分析方法  9
    1.1.4 iso-migrastatin 的生物学活性  9
    1.1.5 iso-migrastatin 的分离提取过程  9-10
  1.2 iso-migrastatin 衍生物研究进展  10-12
    1.2.1 iso-migrastatin 及其衍生物研究进展  10-11
    1.2.2 iso-migrastatin 衍生物合成进展  11
    1.2.3 iso-migrastatin 及其衍生物生物学活性  11-12
  1.3 异源生物合成天然产物  12-18
    1.3.1 异源生物合成聚酮化合物的研究进展  12
    1.3.2 iso-migrastatin 生物合成基因簇的概述  12-15
    1.3.3 构建生物合成iso-migrastatin 的工程菌  15-18
  1.4 实时荧光定量RT-PCR 技术  18-21
    1.4.1 实时荧光定量RT_PCR 技术的原理  18
    1.4.2 实时荧光定量 RT_PCR 的实验步骤  18-21
  1.5 本论文的研究目的  21-22
第二章 Iso-migrastatin 异源生物合成及发酵条件优化  22-40
  2.1 材料与方法  22-25
    2.1.1 实验材料  22-25
      2.1.1.1 实验菌种  22
      2.1.1.2 培养基  22-23
      2.1.1.3 主要试剂  23-24
      2.1.1.4 实验设备  24
      2.1.1.5 iso-migrastatin 的生物合成和检测方法  24-25
  2.2 结果与讨论  25-39
    2.2.1 发酵条件的优化  25-30
      2.2.1.1 生长曲线的测定  25-26
      2.2.1.2 发酵时间对iso-migrastatin 合成的影响  26-27
      2.2.1.3 树脂添加量对iso-migrastatin 产量的影响  27-28
      2.2.1.4 初始pH 值对iso-migrastatin 产量的影响  28-29
      2.2.1.5 接种量对iso-migrastatin 的合成产量的影响  29-30
    2.2.2 iso-migrastatin 培养基成分的优化  30-39
      2.2.2.1 培养基种类的选择  30-31
      2.2.2.2 碳源的种类和浓度对iso-migrastatin 合成的影响  31-32
      2.2.2.3 有机氮源种类和浓度对iso-migrastatin 合成的影响  32-34
      2.2.2.4 无机氮源对iso-migrastatin 合成的影响  34-35
      2.2.2.5 组合培养基对iso-migrastatin 合成的影响  35-37
      2.2.2.6 假想前体对iso-migrastatin 合成的影响  37-39
  2.3 本章小结  39-40
第三章 Real Time RT-PCR 技术  40-52
  3.1 引言  40-41
  3.2 材料与方法  41-48
    3.2.1 实验菌株和培养方法  41
    3.2.2 主要试剂  41-42
    3.2.3 主要实验设备  42
    3.2.4 iso-MGS 同源和异源菌株的培养  42
    3.2.5 链霉菌总RNA 的提取  42-43
    3.2.6 粗提RNA 样品的纯化  43-44
    3.2.7 总RNA 浓度的检测  44-45
    3.2.8 反转录反应  45-46
    3.2.9 荧光定量PCR  46-48
  3.3 结果与讨论  48-50
    3.3.1 总RNA 粗提样品电泳分析  48
    3.3.2 iso-migrastatin 结构基因转录水平分析  48-50
  3.3 本章小结  50-52
第四章 结论与展望  52-54
参考文献  54-58
致谢  58-59
在学期间发表的文章  59

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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