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牛血清白蛋白淀粉样纤维化及其细胞毒性

作　者: 何凤群
导　师: 曾成鸣
学　校: 陕西师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 牛血清白蛋白胰岛素鸡卵清溶菌酶淀粉样纤维分子量细胞毒性
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蛋白质和多肽都能形成富含β折叠且对生物系统有毒性作用的淀粉样纤维。许多研究报道指出淀粉样纤维是蛋白质的一种共同属性。迄今为止,30多种蛋白被证明其所形成的淀粉样纤维与人类疾病有关,如Aβ肽、软蛋白、溶菌酶、胰岛素和α和突出蛋白。蛋白质和多肽的淀粉样变性会导致器官的损伤和功能的丧失,最终引发疾病,如：Ⅱ型糖尿病、阿尔兹海默症、帕金森症、溶血相关的淀粉样沉积和一系列的系统淀粉样变性病。通常情况下,淀粉样纤维在靶细胞的附近沉积,在细胞膜上聚集,引起细胞的连锁反应而导致细胞的死亡。淀粉样物质的形成是一个复杂的过程,形成过程中会形成一系列不同大小、不同形态的异质性的中间物质,包括：寡聚体、原纤维和成熟的纤维。尽管有些研究报道,未成熟的单体、非纤维物质或者不规则的聚集体和成熟的纤维也具有细胞毒性,但是,寡具体和原纤维被证明是淀粉样纤维导致细胞毒性的主要物质。然而,淀粉样变性病的毒性作用的确切机制仍然是个谜。阐明淀粉样纤维的毒性机制对于研制用于治疗淀粉样疾病的药物显得异常重要。在本研究中,选用了一种非致病蛋白—牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象,用以探索纤维化的条件和高分子量蛋白的纤维毒性。鸡卵清溶菌酶和胰岛素的淀粉样纤维用作阳性对照来对比纤维生长的动力学机制和纤维的形态、物理性质以及细胞毒性。本文研究的目的在于阐明蛋白的尺寸和分子量的大小是否是影响蛋白质聚集成有毒性的纤维结构的关键因素。实验所用的研究方法和研究结果：1、BSA纤维化的生长动力学ThT是一种荧光染料,它能和蛋白质中的β折叠结构特异性结合,所以常用来检测淀粉样纤维的生长。结果表明,β折叠的含量随着BSA的孵育而增加,显示纤维结构开始形成。BSA纤维的生长曲线并不呈胰岛素和鸡卵清溶菌酶纤维所呈现出的“S”型曲线。2、ANS荧光检测BSA纤维的表面疏水性ANS是和蛋白质疏水区域相结合的一种荧光染料,其荧光强度和BSA聚集体的表面疏水性相关。结果显示,在BSA纤维化过程中,ANS荧光强度随着孵育时间的增加而下降,同时也没有蓝移现象,这和胰岛素和鸡卵清溶菌酶检测的结果相反。3、圆二色谱法检测BSA纤维圆二色普是用于检测蛋白二级结构变化的一种工具。实验结果表明,在BSA纤维化过程中,α螺旋下降,而β折叠增多,这和胰岛素纤维、鸡卵清溶菌酶纤维形成过程相似。4、BSA纤维的TEM和AFM图AFM和TEM是用来检测纤维形态的常用技术。成熟的BSA淀粉样纤维通过AFM和TEM检测,结果是BSA纤维呈网状的结构,相反,胰岛素纤维和鸡卵清溶菌酶纤维形态长而未分支。5、SDS-PAGE检测BSA纤维和细胞膜的相互作用在进行SDS-PAGE电泳前,将人红细胞膜和淀粉样纤维一起孵育。结果表明,蛋白条带的图谱并没有因为BSA纤维发生改变,同时,细胞骨架蛋白的聚集却发生在经胰岛素纤维和鸡卵清溶菌酶纤维处理后的样品中。这就表明BSA纤维缺乏破坏细胞膜的能力。6、溶血检测检测结果和SDS-PAGE结果一致,BSA纤维并不能影响红细胞的完整性。相反,胰岛素纤维和鸡卵清溶菌酶纤维却能够引起红细胞的溶血。结论：BSA在孵育条件下,能够形成淀粉样纤维。所形成的纤维具有典型的纤维属性,包括β折叠结构的增加,ThT结合和网状纤维结构的形成。和胰岛素纤维、鸡卵清溶菌酶纤维相比,BSA纤维表面疏水性相对于其天然单体比较低,因此也缺乏破坏细胞膜的能力。为此我们得出结论：高分子量蛋白如BSA也能形成淀粉样纤维,但是BSA形成的淀粉样纤维主要因为其表面疏水性较低使其没有细胞毒性。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章引言  9-28
  1.1 论文的选题背景、研究意义及创新之处  9-11
    1.1.1 论文的选题背景  9-10
    1.1.2 论文选题的研究意义  10
    1.1.3 论文的创新之处  10-11
  1.2 淀粉样纤维的研究状况  11-16
    1.2.1 淀粉样纤维的发现及特点  11-13
    1.2.2 淀粉样纤维的形成过程及毒性机制  13-14
    1.2.3 淀粉样纤维的研究进展及淀粉样变性病的相关治疗  14-16
  1.3 蛋白质纤维化的研究状况  16-21
    1.3.1 蛋白质的纤维化  16-17
    1.3.2 胰岛素及胰岛素纤维的研究  17-18
    1.3.3 鸡卵清溶菌酶及其淀粉样纤维的研究进展  18-19
    1.3.4 牛血清白蛋白的研究及其纤维化的研究进展  19-21
  1.4 红细胞及红细胞膜的结构  21-23
  1.5 淀粉样纤维的研究技术  23-28
    1.5.1 外源荧光分析技术  23-25
    1.5.2 圆二色谱(CD)技术  25-26
    1.5.3 透射电镜及原子力显微技术  26
    1.5.4 SDS-PAGE技术  26-28
第二章材料和方法  28-33
  2.1 材料  28-30
    2.1.1 实验试剂及实验仪器  28
    2.1.2 实验试剂的配制  28-30
  2.2 实验方法  30-33
    2.2.1 样品的制备  30
    2.2.2 红细胞及细胞膜的分离  30-31
    2.2.3 ThT荧光检测  31
    2.2.4 ANS荧光检测  31
    2.2.5 透射电镜和原子力显微镜观察纤维的形态  31
    2.2.6 圆二色谱检测  31-32
    2.2.7 电泳检测  32
    2.2.8 红细胞溶血及形态的观察  32
    2.2.9 统计学处理  32-33
第三章实验结果  33-44
  3.1 ThT检测纤维  33-34
  3.2 ANS检测淀粉样纤维的生长情况  34-36
  3.3 透射电镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)鉴别形态  36-37
  3.4 圆二色谱检测淀粉样纤维  37-39
  3.5 溶血检测淀粉样纤维的毒性  39-41
  3.6 SDS-PAGE电泳检测淀粉样纤维及其与膜作用情况  41-44
第四章分析与讨论  44-47
  4.1 外源荧光检测  44-45
  4.2 纤维的形态及其细胞毒性  45-46
  4.3 电泳  46-47
第五章结论  47-48
参考文献  48-55
致谢  55-56
攻读硕士学位期间的研究论文  56

牛血清白蛋白淀粉样纤维化及其细胞毒性

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