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两株家蚕病原菌的分类鉴定及其部分特性研究

作　者: 陶恒平
导　师: 沈中元
学　校: 江苏科技大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 致病性 分类鉴定 核糖体基因 家蚕
分类号: S884
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


家蚕细菌病,又称为“细菌性软化病”,是蚕病中的常见病和多发病。它的发生往往造成蚕业上的严重损失。根据家蚕细菌病病原菌的类型可以分为家蚕细菌性败血病、细菌性中毒病及细菌性肠道病三种。目前,研究发现对家蚕具有病原性的细菌主要有:芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）、气单胞菌属（Aeromonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、链球菌属（Streptococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）。本研究从自然发生的病蚕中分离获得1株对家蚕具有较高致病力的新病原细菌,暂命名为ST-1。该菌株菌落为桔黄色,革兰氏染色为阴性;菌株细胞呈短杆状,直形,两端钝圆,菌体宽0.70.9μm,长1.31.5μm,具端鞭毛,能运动。ST-1菌株为好氧菌,触酶阳性;能还原硝酸盐,使明胶液化;V-P（Voges-Proskauer reaction）、M.R.（Methyl Red test,甲基红试验）、吲哚试验、H2S产生试验和苯丙氨酸反应阴性;能利用柠檬酸盐、丙二酸盐、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖和阿拉伯糖等。结合16S rRNA基因序列分析结果,最终鉴定ST-1菌株是一株桔黄假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca）。通过注射感染5龄正常起蚕,初步研究发现,该菌株能引起家蚕细菌性败血病。其致病力回归方程为y = 0.4040 + 0.0600x,半数致死浓度LC50= 2.12×104 CFU/mL。这是首次发现桔黄假单胞菌对家蚕有致病性。家蚕黄僵病病原菌黄僵菌过去认为属束梗孢科（Stilbaceae）,棒束菌属（Isaria）,学名为Isaria farinasa。而家蚕球孢白僵菌（Beauveria bassiana）在最新的NCBI真菌分类上,属于子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌亚纲（Hypocreomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、虫草菌科（Cordycipitaceae）、虫草菌属（Cordyceps）。近年研究证明,由于黄僵菌和球孢白僵菌在形态上的差异极小,多数学者认为本病菌与球孢白僵菌（Beauveria bassiana）同属同种,只是血清型不同。本研究从一条自然发生的黄僵病蚕中分离获得一株家蚕黄僵菌菌株STH1,其分生孢子多为球形,比家蚕球孢白僵菌菌株SHB小。在PDA培养基上培养12 d,STH1菌株营养菌丝生长情况为4.25±0.81 mm·d-1,而SHB为4.75±1.00 mm·d-1,其生长速度快于STH1。培养15 d后,STH1的产孢量为9.82±3.49×108孢子/cm2,SHB为4.01±2.12×108孢子/cm2,在α= 0.01水平上,两者差异极显著。对黄僵菌菌株STH1进行分子生物学鉴定,STH1的核糖体内转录间隔区ITS序列长为549 bp,白僵菌菌株SHB也为549 bp,两者同源相似性为100%。以此序列构建的系统发育树表明,STH1菌株与多株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）聚类在同一分支。STH1的18S rRNA基因序列长为1 766 bp,其内有一段1 866 bp的组I内含子的插入序列,能编码归巢核酸内切酶。对菌株STH1的18S rRNA、28S rRNA和基因间间隔区IGS序列与白僵菌菌株SHB的相应序列进行同源性分析,也表明两种菌株相似性近乎100%。因此,我们最终认为家蚕黄僵菌属于球孢白僵菌（Cordyceps bassiana）;而菌株STH1是一株含有第I组类内含子的球孢白僵菌新菌株。本研究通过对家蚕未知病原菌ST-1和黄僵菌STH1的系统鉴定,确立了这两种病原菌的分类地位,也为其诊断防治等奠定了一定基础。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第1章 绪论  14-23
  1.1 研究背景与意义  14-15
    1.1.1 家蚕细菌病  14-15
    1.1.2 家蚕黄僵病与白僵病  15
  1.2 系统分类单元及系统发育学研究进展  15-17
    1.2.1 微生物分类学中的系统分类单元  15-16
    1.2.2 微生物系统发育学研究进展  16-17
  1.3 病原菌鉴定方法的研究进展  17-20
    1.3.1 病原细菌鉴定方法的研究进展  17-19
    1.3.2 病原真菌鉴定方法的研究进展  19-20
  1.4 家蚕败血病和黄僵病的诊断与防治研究进展  20-22
    1.4.1 细菌性败血病  20-21
    1.4.2 黄僵病  21-22
  1.5 本论文研究的主要工作  22-23
第2章家蚕细菌病病原菌株ST-1 的分离鉴定  23-37
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 菌种来源  23
    2.1.2 载体、酶、宿主菌和主要试剂  23
    2.1.3 常用溶液、缓冲液和培养基的配制  23-25
    2.1.4 主要实验仪器和设备  25
    2.1.5 生物信息学分析软件  25
  2.2 实验方法  25-30
    2.2.1 ST-1 的分离纯化  25
    2.2.2 ST-1 的菌落形态和显微形态观察  25-26
    2.2.3 生理生化指标的测定  26-27
    2.2.4 基因组DNA 的提取  27
    2.2.5 基因序列测定的常规实验操作方法  27-30
  2.3 实验结果  30-34
    2.3.1 ST-1 菌株的菌落形态观察结果  30-31
    2.3.2 ST-1 菌株显微形态观察结果  31
    2.3.3 ST-1 菌株的生理生化特征  31-32
    2.3.4 ST-1 菌株的16S rRNA 序列分析结果  32-34
  2.4 讨论  34-37
第3章 ST-1 菌株对家蚕致病力的初步研究  37-40
  3.1 实验材料  37
    3.1.1 材料  37
    3.1.2 主要仪器  37
  3.2 实验方法  37
    3.2.1 ST-1 的回复感染  37
    3.2.2 ST-1 菌悬液的制备及菌落计数  37
    3.2.3 对家蚕的致病力试验  37
  3.3 实验结果  37-39
    3.3.1 ST-1 菌株感染家蚕发病特征  37-38
    3.3.2 ST-1 菌株对家蚕致病力的分析  38-39
  3.4 讨论  39-40
第4章家蚕黄僵病病原菌株STH1 的分类鉴定研究  40-48
  4.1 实验材料  40
    4.1.1 供试菌株  40
    4.1.2 常用培养基  40
    4.1.3 其它材料与主要仪器  40
  4.2 实验方法  40-43
    4.2.1 STH1 的分离与纯化  40-41
    4.2.2 菌株形态学观察  41
    4.2.3 营养菌丝生长情况及产孢量  41
    4.2.4 基因组DNA 的提取  41-42
    4.2.5 核糖体rRNA 基因的序列测定  42-43
  4.3 实验结果  43-47
    4.3.1 形态观察结果  43-44
    4.3.2 营养菌丝生长结果  44-45
    4.3.3 产孢量结果  45
    4.3.4 核糖体序列分析结果  45-47
  4.4 讨论  47-48
结论  48-50
参考文献  50-56
附录1 桔黄假单胞菌ST-1 16S ribosomal RNA 基因部分序列（GU947817）  56-58
附录2 家蚕黄僵菌STH1 核糖体基因全序列（JF429895）  58-66
附录3 家蚕白僵菌SHB 核糖体基因全序列（JF429894）  66-74
攻读硕士学位期间发表的论文  74-76
致谢  76-77
详细摘要  77-81

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 蚕的病虫害及其防治
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