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低剂量辐射（LDR）对DNA-PKcs基因沉默人乳腺上皮细胞DNA修复相关蛋白表达的影响

作　者: 车鉴
导　师: 邹伟
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 动物学
关键词: 低剂量辐射非同源性末端连接同源重组 DNA-PKcs ATM
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

乳腺癌通常指发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。全世界每年患乳腺癌的妇女多达120万人,且发病率以每年0.2%～8%的速度上升。在美国,乳腺癌一直处于女性癌症的第一位,而我国乳腺癌的发病率也有逐年增高趋势,现已位于女性癌症第二位,仅次于子宫癌,是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤。目前,乳腺癌主要采用手术治疗、化学药物治疗（简称化疗,Chemotherapy）和放射治疗（简称放疗,Radiotherapy）等综合治疗体系。放疗作为乳腺癌治疗最为有效的手段之一,可减少复发率和死亡率,在乳腺癌治疗中起到了十分重要的作用。但是,放疗在最大限度地控制肿瘤的同时也会对周围正常组织产生放射旁效应（放疗的副作用）。放射旁效应主要是指,在对癌细胞DNA作为靶点辐射时,对周围正常细胞DNA成损伤的效应,即由低剂量放射（low dose radiation,LDR）所引起的DNA双链断裂（double-strand breaks,DSBs）。靶点周围正常细胞对DSBs的修复是降低放疗副作用的最佳途径,因此,研究低剂量辐射的DNA修复机制具有重要的意义。细胞对DSBs损伤的修复方式主要有两种:以DNA依赖蛋白激酶（DNA-dependentprotein kinase,DNA-PK）为主的非同源性末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）修复和以ATM为主的同源重组（Homologous recombination,HR）修复。ATM（ataxia-telangiectasia mutanted）蛋白激酶是HR修复修通路的关键蛋白,它是毛细血管扩张性共济失调症突变基因（atm）编码的一种磷酸化的大分子核磷蛋白,分子量约为350kD。ATM作为P53的重要调节物质,主要功能是参与细胞周期的调控、DNA损伤识别和修复。尽管ATM介导的HR修复通路可恢复DNA链的连续性,但在哺乳动物细胞DSBs修复过程中,NHEJ途径起主要作用。NHEJ修复途径主要依赖4个核心因子:DNA-PK、XRCC4、DNA接酶Ⅳ和Artemis。其中DNA-PK包含一个具有丝/苏氨酸激酶活性的催化亚基DNA-PKcs和两个能启动NHEJ修复的Ku亚基。DNA-PKcs是一个重要的损伤修复蛋白,除在NHEJ、VDJ重组和维持端粒结构中起关键作用外,还可磷酸化诸多转录因子和修复因子。近年来研究发现,DNA-PK表达缺失或下调不仅表现出DSBs修复障碍,还可使细胞对低剂量的电离辐射的敏感性增加,提示它在细胞对LDR进行应答中起到重要的作用,与一些肿瘤的发生发展具有密切的联系,其作用机制是近年来国际关注的热点。本研究模拟乳腺放疗中的放射旁效应,以人乳腺上皮细胞系（MCF10）为对象,首先研究了低剂量辐射对细胞生长和增殖的影响;然后,检测了不同的DNA损伤修复信号通路（HR和NHEJ通路）、增殖信号通路（MAPK/ERK通路）以及生存信号通路（PI3K/AKT通路）中主要信号蛋白表达的变化,确定低剂量辐射的信号分子效应;进一步利用siRNA干扰技术沉默人乳腺细胞DNA-PKcs基因,观察了DNA-PKcs基因沉默细胞对LDR的敏感性以及DSBs修复相关蛋白表达水平的影响,探讨了人乳腺上皮细胞对LDR敏感性变化的可能机制以及DNA-PKcs的作用,旨在了解正常人乳腺上皮细胞对LDR造成细胞DSBs后的反应以及DNA修复的机制。实验主要分为两部分:（一）LDR对人乳腺上皮细胞DNA修复相关蛋白表达的影响用50 cGy和100 cGy照射人乳腺上皮细胞,MTF法观察LDR对乳腺细胞增殖以及倍增时间的影响以检测细胞对LDR的敏感性变化,Western blot检测了LDR诱导的不同时间点（2小时、12小时和24小时）DNA-PKcs和ATM介导的DNA修复通路、MAPK介导的增殖通路、P13K/AKT介导的生存通路以及Cav-1和NF-kB等相关蛋白表达水平。结果表明:（1）50 cGy和100 cGy照射后,细胞增殖均受到抑制,100 cGy的抑制作用明显,提示,乳腺细胞对LDR的敏感性具有剂量依赖性。（2）100cGyγ射线辐射可引起乳腺细胞内ATM、P53、DNA-PKcs等DNA修复相关蛋白表达明显增加,提示低剂量引起DNA-DSBs的修复既可以通过HR,也可以通过NHEJ通路完成。（3）100cGyγ射线辐射可引起乳腺细胞MAPK、AKT蛋白活性增强,转录因子NF-kB和乳腺癌抑癌基因Cav-1表达增加,提示LDR对乳腺细胞的效应与Cav-1介导的增殖和存活通路与DNA修复通路的共同作用有关。结论:LDR能够引起人乳腺上皮细胞DNA损伤,增加细胞的辐射敏感性,其修复机制是HR和NHEJ通路被激活,细胞增殖和存活相关蛋白也参与LDR引起的损伤修复和调节。（二）LDR对DNA-PKcs基因沉默的乳腺上皮细胞DNA修复相关蛋白表达的影响利用siRNA干扰技术使人乳腺上皮细胞DNA-PKcs基因沉默,用50 cGy和100 cGy照射细胞,MTT法观察LDR对乳腺细胞增殖的影响,Western blot检测DNA修复相关蛋白ATM、Ku80和P53等表达的变化。结果表明:（1）成功地建立了DNA-PKcs基因沉默细胞模型(MCF10^pk),DNA-PKcs基因表达比对照下调90%;（2）DNA-PKcs基因沉默细胞MCF10^pk对100cGy LDR辐射敏感度增大,细胞生长减慢;（3）LDR均可使MCF10细胞P53蛋白、Ku80等DNA修复相关蛋白表达增多,但DNA-PKcs基因沉默细胞MCF10^pk中的蛋白表达水平明显低与对照组。结论:DNA-PKcs基因沉默可抑制乳腺上皮细胞对LDR损伤的修复,其机制可能与MCF10^pk细胞中DNA-PKcs蛋白表达缺失,导致NHEJ DNA损伤修复通路受阻有关。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章文献综述  11-18
  1.1 ATM基因的结构和功能  11-12
    1.1.1 ATM基因的结构特征  11-12
    1.1.2 ATM基因的功能  12
  1.2 ATM基因与乳腺癌  12-15
    1.2.1 ATM在乳腺中的表达  12-13
    1.2.2 ATM基因和乳腺癌的发病率  13-15
  1.3 展望  15-16
  参考文献(References)  16-18
第二章 LDR对人乳腺上皮细胞DNA修复相关蛋白表达的影响  18-37
  前言  18-19
  2.1 材料与方法  19-20
    2.1.1 材料和试剂  19
    2.1.2 主要仪器  19-20
  2.2 方法  20-24
    2.2.1 细胞培养  20
    2.2.2 细胞LDR辐射处理  20-21
    2.2.3 蛋白样品制备与定量  21-22
    2.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳  22-23
    2.2.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)  23-24
    2.2.6 统计分析  24
  2.3 结果  24-30
    2.3.1 人乳腺上皮细胞对LDR的敏感性具有剂量和时间依赖性  24-25
    2.3.2 LDR对人乳腺上皮细胞DNA修复相关蛋白表达的影响  25-27
    2.3.3 LDR对人乳腺上皮细胞增殖和存活通路相关蛋白表达的影响  27-29
    2.3.4 LDR对人乳腺上皮细胞Caveolin-1蛋白表达的影响  29-30
  2.4 讨论  30-33
  2.5 小结  33-35
  参考文献(Refereneces)  35-37
第三章 LDR对DNA-PKcs基因沉默乳腺上皮细胞DNA损伤修复相关蛋白表达的影响  37-49
  前言  37
  3.1 材料与方法  37-38
    3.1.1 材料和试剂  37-38
    3.1.2 主要仪器  38
  3.2 方法  38-39
    3.2.1 细胞培养  38
    3.2.2 siRNA的瞬时转染  38-39
    3.2.3 蛋白样品制备与定量  39
    3.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳  39
    3.2.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)  39
    3.2.6 统计分析  39
  3.3 结果  39-44
    3.3.1 DNA-PKcs基因沉默细胞模型的建立  39
    3.3.2 DNA-PKcs基因沉默使细胞对LDR的敏感性增加  39-40
    3.3.3 LDR对DNA-PKcs基因沉默乳腺上皮细胞DNA修复相关蛋白表达的影响  40-44
  3.4 讨论  44-46
  3.5 小结  46-47
  参考文献(Refereneces)  47-49
致谢  49-51
作者简介  51

低剂量辐射（LDR）对DNA-PKcs基因沉默人乳腺上皮细胞DNA修复相关蛋白表达的影响

内容摘要

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