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酿酒酵母ALD4基因敲除与GPD1基因沉默研究

作　者: 曹罗元
导　师: 陈由强
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 酿酒酵母 乙醛脱氢酶 甘油脱氢酶 反义技术 基因敲除 同源重组
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


乙酸与甘油是酿酒酵母乙醇发酵过程主要的副产物。本研究通过敲除酿酒酵母Y01乙醛脱氢酶ALD4基因,获得了ALD4基因缺失的突变体DY01；通过构建反义表达载体抑制酿酒酵母甘油脱氢酶关键基因GPD1的转录,以促进乙醇发酵。结果如下：1.采用以PCR为基础的loxP-KanMX-loxP序列组件和Cre/loxP删除系统删除了酿酒酵母工程菌Y01乙醛脱氢酶ALD4基因,获得突变株DY01；酿酒酵母ALD4缺失菌株DY01发酵液乙醇比出发菌株酿酒酵母Y01提高了6.88%。2.通过构建酿酒酵母实验菌株INVScl甘油脱氢酶GPD1基因5’UTR反义表达载体pYES2.0-GPD1,实验组比对照组的3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)的比活力最大下降了24.03%；甘油产量含量下降幅度最大达到了25.43%,而且甘油含量的下降滞后于3.磷酸甘油脱氢酶活性的下降。3.通过构建酿酒酵母突变株DY01甘油脱氢酶GPD1基因5’UTR反义表达载体pYES2.0-GPD1/KanMX,获得酿酒酵母DRY01菌株；酿酒酵母DRY01菌株的甘油脱氢酶(GPDH)的比活力比出发菌株DY01下降了20.04%；甘油含量下降幅度最大达到了19.14%；同时,酿酒酵母DRY01发酵液乙醇含量比酿酒酵母DY01提高了9.74%,比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.01%。建立在酵母高效同源重组机制的loxP-KanMX.loxP删除组件与Cre/loxP系统是进行酿酒酵母基因改良育种与酿酒酵母基因功能相关研究的有效方法,突破了工业酿酒酵母缺乏有效选择标记与遗传多样性的限制。酿酒酵母ALD4基因的缺失,有利于乙醇代谢途径。酿酒酵母工程菌株DY01 GPD1基因mRNA 5’UTR的反义RNA能够有效的抑制酿酒酵母工程菌株DY01GPD1基因的转录,触发沉默该基因的表达；为提高甘蔗等生物质发酵燃料乙醇效率迈出重要一步,为酿酒酵母工程菌的基因改良奠定了基础。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-4
中文文摘  4-6
目录  6-10
绪论  10-24
  第一节 课题研究背景  10-11
  第二节 酿酒酵母研究背景  11-12
  第三节 酿酒酵母乙醛脱氢酶的研究状况  12-13
    1)乙醛脱氢酶Ⅱ(ALD2)  13
    2)乙醛脱氢酶Ⅲ(ALD3)  13
    3)乙醛脱氢酶Ⅳ(ALD4)  13
    4)乙醛脱氢酶Ⅴ(ALD5)  13
    5)乙醛脱氢酶Ⅵ(ALD6)  13
  第四节 酿酒酵母甘油脱氢酶的研究状况  13-17
  第五节 酿酒酵母育种技术  17-22
    5.1 诱变育种  17
    5.2 细胞融合法  17-18
    5.3 基因工程法  18-22
      5.3.1 引入异源基因构建基因工程菌株  18-20
      5.3.2 调控酿酒酵母代谢途径  20-22
        5.3.2.1 PCR介导的酿酒酵母基因敲除技术  20
        5.3.2.2 调控酿酒酵母mRNA转录途径  20-22
          5.3.2.2.1 反义技术调控mRNA转录  21-22
  第六节 本课题研究内容与目的  22-24
    6.1 研究目的  22
    6.2 研究内容  22-24
第一章 删除酿酒酵母工程菌ALD4基因  24-48
  第一节 前言  24
  第二节 材料方法  24-37
    2.1 材料  24-26
      2.1.1 菌株与质粒  24-25
      2.1.2 主要试剂  25
      2.1.3 培养基与试剂配制  25-26
      2.1.4 主要设备与仪器  26
      2.1.5 引物设计  26
    2.2 方法  26-35
      2.2.1 Cre/loxP系统  26-27
      2.2.2 酿酒酵母基因组提取  27
      2.2.3 质粒DNA制备  27
      2.2.4 酵母菌ALD4基因存在验证  27-28
      2.2.5 基因删除组件的构建  28-29
      2.2.6 基因删除组件的验证  29-32
        2.2.6.1 酿酒酵母ALD4删除组件PCR产物胶回收  29
        2.2.6.2 PCR回收产物的连接与转化  29-31
          2.2.6.2.1 DH5α感受态细胞的制备  30
          2.2.6.2.2 CaCl_2法转化DH5α感受态细胞  30-31
        2.2.6.3 阳性克隆的鉴定与质粒提取  31-32
        2.2.6.4 阳性克隆质粒测序  32
      2.2.7 ALD4基因的删除  32-33
      2.2.8 克隆子验证  33-34
      2.2.9 筛选标记的切除和重复利用  34-35
    2.3 酿酒酵母Y01与DY01生长试验  35
    2.4 酿酒酵母Y01与DY01发酵性能评估  35-37
      2.4.1 酿酒酵母Y01与DY01粗酶液的提取  35-36
      2.4.2 酿酒酵母Y01与DY01乙醛脱氢酶酶活测定  36
      2.4.3 酿酒酵母Y01与DY01发酵产物乙醇检测  36-37
  第三节 结果与分析  37-46
    3.1 酿酒酵母基因组的提取  37
    3.2 酵母菌基因ALD4验证  37-38
    3.3 构建ALD4基因删除组件  38-39
    3.4 删除组件的测序验证  39
    3.5 删除组件同源重组验证  39-40
    3.6 KanMX选择标记的切除  40-41
    3.7 删除ALD4另一条等位基因  41-42
    3.8 酿酒酵母Y01与DY01生长试验  42-43
    3.9 酿酒酵母Y01与DY01发酵性能评估  43-46
      3.9.1 酿酒酵母Y01与DY01粗酶液的定量  43-44
      3.9.2 酿酒酵母Y01与DY01乙醛脱氢酶酶活测定  44-45
      3.9.3 酿酒酵母Y01与DY01发酵产物乙醇检测  45-46
  第四节 小结与讨论  46-48
第二章 酿酒酵母INVS1 GPD1基因沉默研究  48-62
  第一节 前言  48
  第二节 材料与方法  48-56
    2.1 材料  48-50
      2.1.1 菌株与质粒  48-49
      2.1.2 主要试剂  49
      2.1.3 主要培养基与试剂配制  49
      2.1.4 主要仪器设备  49-50
    2.2 方法  50-56
      2.2.1 反义表达载体插入片段的扩增  50-52
        2.2.1.1 酿酒酵母INVSc1基因组DNA的提取  50
        2.2.1.2 扩增反义组件引物设计  50-51
        2.2.1.3 反义片段的扩增  51-52
      2.2.2 重组表达质粒的构建  52-54
      2.2.3 重组表达质粒酶切鉴定  54-55
      2.2.4 感受态细胞的制备与转化筛选  55
      2.2.5 重组菌pYES2.0-GPD1/pYES2.0的诱导表达  55
      2.2.6 重组菌pYES2.0-GPD1/pYES2.0GPDH酶活检测  55
      2.2.7 重组菌pYES2.0-GPD1/pYES2.0甘油含量检测  55-56
  第三节 结果与分析  56-59
    3.1 pYES2.0-GPD1反义表达组件的构建  56-57
    3.2 重组质粒的酶切鉴定  57-58
    3.3 酿酒酵母INVSc1-pYES2.0/INVSc1-pYGPD1酶活检测  58-59
    3.4 酿酒酵母INVSc1-pYES2.0/INVSc1-pYGPD1甘油定量  59
  第四节 小结与讨论  59-62
第三章 酿酒酵母DY01 GPD1基因沉默研究  62-80
  第一节 前言  62
  第二节 材料与方法  62-70
    2.1 材料  62-63
      2.1.1 菌株与质粒  62
      2.1.2 主要试剂  62
      2.1.3 主要培养基与试剂配制  62-63
      2.1.4 主要仪器设备  63
    2.2 方法  63-70
      2.2.1 重叠延伸PCR引物的设计  63-66
        2.2.1.1 酿酒酵母DY01基因组DNA的提取  64
        2.2.1.2 反义片段的扩增  64-66
          2.2.1.2.1 反义组件SGPD1片段扩增  64-65
          2.2.1.2.2 抗性选择标记KanMX片段扩增  65-66
          2.2.1.2.3 工程菌GPD1基因5'UTR扩增  66
      2.2.2 重组表达质粒的构建  66-68
      2.2.3 重组反义表达载体鉴定  68-69
      2.2.4 酿酒酵母感受态细胞的制备与转化筛选  69
      2.2.5 重组菌DY01 pYES2.0-GPD1/KanMX的诱导表达  69
      2.2.6 重组菌DY01 pYES2.0-GPD1/KanMX酶活检测  69
      2.2.7 重组菌pYES2.0-GPD1/KanMX甘油含量检测  69
      2.2.8 酿酒酵母DY01与DRY01发酵产物乙醇检测  69-70
  第三节 结果与分析  70-77
    3.1 pYES2.0-GPD1/KanMX反义表达组件的构建  70-71
      3.1.1 酿酒酵母SGPDl基因与KanMX基因的扩增  70
      3.1.2 重叠延伸PCR扩增SGPD1/KanMX片段  70-71
    3.2 反义组件GPD1/KanMX的克隆  71-74
    3.3 酿酒酵母Y01与DRY01生长曲线测定  74-75
    3.4 酿酒酵母DY01与DRY01 GPDH酶活检测  75-76
    3.5 酿酒酵母DY01与DRY01甘油含量检测  76
    3.6 酿酒酵母DY01与DRY01乙醇含量检测  76-77
  第四节 小结与讨论  77-80
第四章 结论  80-82
参考文献  82-88
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  88-90
致谢  90-92
个人简历  92-93

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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