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苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因与球孢白僵菌CDEP2基因的融合表达及功能研究

作　者: 曾智
导　师: 丁学知；夏立秋
学　校: 湖南师范大学
专　业: 发酵工程
关键词: 苏云金芽胞杆菌 球孢白僵菌 cry1Ac基因 CDEP2基因 Red/ET同源重组技术 Western blot
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


为了构建杀虫毒力高和杀虫谱广的苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis,简称Bt）工程菌株,利用本研究室筛选的Bt高毒力菌株Bt4.0718（CCTCC No.200016）中的cry1Ac基因和在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）中新发现的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因构建融合基因和表达融合蛋白来提高Bt晶体蛋白的杀虫毒力。根据GenBank上球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出本研究室保存的球孢白僵菌中的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的cDNA全序列。经过比较后发现该基因是球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因家族的新成员（GenBank登录号:EF195164）。该基因中1137bp的开放阅读框编码一个含379个氨基酸、分子量为38.8KDa、pI=8.21的蛋白酶前体。将CDEP2基因的cDNA序列连接到融合表达载体pET28a（+）的多克隆位点,构建重组质粒并转化到大肠杆菌（E.coli）BL21菌株中。将经过IPTG诱导后的重组菌株进行SDS-PAGE检测,结果表达了42KD的（His）6-CDEP2蛋白。将纯化后的CDEP2蛋白来免疫新西兰公兔,制备了该蛋白的多克隆抗体。以本研究室已经成功构建好的重组质粒pHT-cry1Ac-HwtxⅪ作为靶标质粒,通过Red/ET同源重组技术,将其中的蜘蛛蛋白酶抑制剂基因（HwtxⅪ）重组替换成CDEP2基因,构建新的重组质粒pHT-cry1Ac-CDEP2。将该重组质粒电转化到Bt无晶体突变株Cry-B中,构建新的重组工程菌株Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2。SDS-PAGE和Western blot检测证明融合蛋白在重组菌株中得到表达。对Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株和Cry-B-pHT-cry1Ac菌株研究比较发现,前者形成晶体所需时间明显比后者缩短,晶体蛋白表达量明显增加。生测结果表明Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株发酵液对棉铃虫（Helicoverpa armigera）三龄幼虫有高效杀虫活性,生测72h后的LC50值为8.50μl/ml,比对照菌株Cry-B-pHT-cry1Ac降低了49.1%。本研究首次将杀虫真菌中的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因与Btcry1Ac基因融合,并使其在Bt中融合表达,为拓宽Bt杀虫谱、提高杀虫毒力和延缓害虫对Bt产生抗性等研究提供了基础。Red/ET同源重组技术为Bt cry基因和其它外源毒素基因的融合以及构建高毒力的Bt工程菌株提供了一个全新的分子生物学技术平台。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
引言  10-30
  1.微生物杀虫农药研究背景  10
  2.苏云金芽胞杆菌概述  10-11
  3.苏云金芽胞杆菌毒素种类  11-12
  4.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白  12-17
    4.1 杀虫晶体蛋白基因的命名和分类  12-16
    4.2 杀虫晶体蛋白的基本特征  16
    4.3 杀虫晶体蛋白的结构特征  16-17
  5.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理  17-20
    5.1 杀虫晶体蛋白与昆虫细胞膜上受体的结合  18-19
    5.2 杀虫晶体蛋白引起膜穿孔的分子机制  19
    5.3 杀虫晶体蛋白导致细胞裂解的机制  19-20
  6.苏云金芽胞杆菌的研究应用现状  20-23
    6.1 寻找苏云金芽胞杆菌新资源和发掘新的杀虫基因  20-21
    6.2 苏云金芽胞杆菌工程菌的构建和应用  21
    6.3 苏云金芽胞杆菌安全性方面的研究  21-22
    6.4 苏云金芽胞杆菌融合基因的研究  22-23
  7.球孢白僵菌的概述  23
  8.球孢白僵菌的杀虫机理  23-24
  9.球孢白僵菌杀虫毒蛋白  24-25
  10.Red/ET同源重组技术  25-29
  11.实验目的和意义  29-30
材料与方法  30-44
  1.材料  30-35
    1.1 菌株和质粒  30
    1.2 培养基和抗生素  30-32
    1.3 试剂和仪器设备  32-35
  2.方法  35-44
    2.1 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的克隆  35-39
    2.2 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的表达  39-40
    2.3 Red/ET同源重组构建表达载体pHT-crylAc-CDEP2  40-41
    2.4 重组菌株Cry ~-B-pHT-crylAc-CDEP2的构建  41
    2.5 多克隆抗体的制备和检测  41-42
    2.6 融合蛋白的Western blot检测  42-43
    2.7 重组菌株的杀虫毒力生测  43-44
结果与分析  44-60
  1.球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的克隆  44-50
    1.1 球孢白僵菌总RNA的提取  44
    1.2 RT-PCR合成CDEP2基因的cDNA双链  44-45
    1.3 重组质粒pMD-CDEP2的筛选和鉴定  45-46
    1.4 重组质粒pMD-CDEP2测序结果和同源性分析  46-49
    1.5 重组质粒pET-CDEP2的筛选和鉴定  49-50
  2.球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的表达  50-52
    2.1 SDS-PAGE检测诱导表达的目的蛋白  50
    2.2 目的蛋白的分离纯化  50-52
  3.表达载体pHT-crylAc-CDEP2的构建  52-55
    3.1 Red/ET同源重组材料的制备  52-53
    3.2 表达载体pHT-crylAc-CDEP2的酶切鉴定  53-54
    3.3 融合基因片段上下游序列分析  54-55
  4.重组菌株Cry ~-B-pHT-crylAc-CDEP2的构建  55-57
    4.1 重组菌株Cry~-B-pHT-crylAc-CDEP2的菌落PCR鉴定  55-56
    4.2 重组菌株Cry~-B-pHT-crylAc-CDEP2的SDS-PAGE检测  56-57
  5.融合蛋白的Western blot检测  57-59
  6.重组菌株的杀虫毒力生测  59-60
讨论  60-68
  1.以crylAc基因为基础构建杀虫融合基因的研究  60
  2.RT-PCR扩增CDEP2基因cDNA序列的方法  60-61
  3.CDEP2蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备  61-62
  4.关于两种制备抗原方法的比较  62-63
  5.融合基因表达系统的构建策略  63-64
  6.融合蛋白形成晶体的研究  64-65
  7.Red/ET同源重组技术的应用  65
  8.融合蛋白的毒理研究  65-66
  9.总结  66-68
结论  68-70
  1.球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶新基因CDEP2的克隆和表达  68
  2.CDEP2多克隆抗体的制备  68
  3.Red/ET同源重组技术  68
  4.融合基因的克隆和表达  68
  5.苏云金芽胞杆菌工程菌株的毒力生测  68-70
参考文献  70-78
附录  78-79
本人在硕士研究生期间撰写、发表和参与课题相关的科研成果和学术论文  79-80
致谢  80-82

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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