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肺炎克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶和16S rRNA甲基化酶耐药基因研究

作　者: 叶春枚
导　师: 刘文恩
学　校: 中南大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肺炎克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶 16s rRNA甲基化酶 PCR
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的调查中南大学湘雅医院临床分离的肺炎克雷伯菌药物敏感性,检测氨基糖苷类修饰酶和16S rRNA甲基化酶基因,探讨肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制,为临床抗菌药物选用提供实验室依据。方法1.收集中南大学湘雅医院2009年1月至2009年7月间非重复肺炎克雷伯菌96株,所有菌株采用法国梅里埃公司的全自动微生物鉴定系统VITEK-2的革兰阴性菌GN卡鉴定和AST GN-13卡进行药敏分析。采用琼脂稀释法对庆大霉素,阿米卡星,妥布霉素进行MIC检测。2.采用PCR法对氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3’)-Ⅵa和16s rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA进行检测；3.将扩增的DNA产物纯化后进行测序分析,将测序结果通过BLAST与基因库已知序列进行对比分析,确定其基因型。4.将96株肺炎克雷伯菌耐药基因型与耐药表型进行比较分析,探讨耐药基因与耐药表型的关系。结果1.96株肺炎克雷伯菌对庆大霉素的耐药率达到63.5%,对妥布霉素的耐药率是41.7%,对阿米卡星耐药率最低,仅为21.9%,对阿米卡星耐药的菌株均对庆大霉素和妥布霉素耐药。三种氨基糖苷类药物的MIC50和MIC90分别≥256μg/ml和>512μg/ml。2.经过氨基糖苷类修饰酶基因PCR扩增及测序分析,96株肺炎克雷伯菌中有18.8%的菌株携带aac(3)-Ⅰ基因(18／96)、57.3%的菌株携带aac(6’)-Ⅰb基因(55／96)、3.1%的菌株携带ant(3")-Ⅰ基因(3／96)。3.aac(6’)-Ⅰb是氨基糖苷类修饰酶基因中最常见的基因型,在环丙沙星敏感菌和耐药菌中aac(6’)-Ⅰb携带率分别为50%(36／72)和79.1%(19／24),经x2检验差异具有统计学意义(x2=6.26,P<0.05)。4.经16s rRNA甲基化酶基因PCR扩增和测序分析,有22株携带armA基因,占22.9%(22／96),其中77.3%(17／22)产armA型甲基化酶基因的菌株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星同时耐药且都为高度耐药(MICs≥512μg/ml),未检测出aph(3’)-Ⅵa及rmtA、rmtB rmtC、rmtD、npmA型甲基化酶基因。结论1.首次在湖南地区发现aac(3)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ型氨基糖苷类修饰酶基因及armA型16s rRNA甲基化酶耐药基因,氨基糖苷类修饰酶基因以aac(6’)-Ⅰb为主,armA型16s rRNA甲基化酶耐药基因携带率高。2.肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗生素的耐药非常严重,阿米卡星耐药率最低,对阿米卡星耐药的肺炎克雷伯菌均对庆大霉素和妥布霉素耐药,阿米卡星可作为氨基糖苷类耐药基因筛查的抗菌药物。3.产aac(6’)-Ib基因的肺炎克雷伯菌对环丙沙星耐药率明显高于不产aac(6’)-Ib基因的肺炎克雷伯菌对环丙沙星耐药率；产armA型16s rRNA甲基化酶基因的肺炎克雷伯菌大多对氨基糖苷类抗生素呈高度耐药。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-12
缩略词表  12-13
第一章前言  13-15
第二章材料和方法  15-20
  2.1 材料  15-16
    2.1.1 临床菌株  15
    2.1.2 主要试剂  15-16
    2.1.3 主要仪器  16
  2.2 方法  16-20
    2.2.1 技术路线  16-17
    2.2.2 细菌的培养、鉴定、药敏及保存  17
    2.2.3 琼脂稀释法进行MIC检测  17
    2.2.4 细菌DNA提取  17
    2.2.5 氨基糖苷类修饰酶基因PCR扩增  17-18
    2.2.6 16s rRNA甲基酶基因PCR扩增  18
    2.2.7 琼脂糖凝胶电泳  18
    2.2.8 PCR产物测序  18-19
    2.2.9 统计学分析  19-20
第三章结果  20-32
  3.1 抗菌药物敏感性结果  20
  3.2 氨基糖苷类修饰酶AMEs基因结果  20
  3.3 16s rRNA甲基化酶基因扩增结果  20-26
  3.4 测序结果  26-27
  3.5 96株肺炎克雷伯菌的基因型和表型比较结果  27-32
第四章讨论  32-36
  4.1 抗菌药物敏感性分析与讨论  32
  4.2 氨基糖苷类修饰酶基因结果与讨论  32-33
  4.3 16S rRNA甲基化酶基因结果与讨论  33-35
  4.4 96株肺炎克雷伯菌的基因型和表型分析与讨论  35-36
第五章结论  36-37
参考文献  37-41
综述  41-51
致谢  51-52
攻读学位期间研究成果  52

肺炎克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶和16S rRNA甲基化酶耐药基因研究

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