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日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白的基因克隆、表达及相关免疫生物学特性的研究

作　者: 张纯
导　师: 朱荫昌
学　校: 江苏省血吸虫病防治研究所
专　业: 病原生物学
关键词: 日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白基因克隆原核表达免疫生物学特性免疫保护作用
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

血吸虫病对人类造成的危害极大,全球约有7.79亿人受到威胁,约有2亿人感染,每年因血吸虫病死亡的人数约25万。我国是日本血吸虫病流行最严重的国家。经过60多年的积极防治,虽然已取得巨大成就,但在湖区5省(江苏、安徽、江西、湖北和湖南)及山区2省(四川、云南)等地区,仍有约41.3万患者。吡喹酮能有效治疗血吸虫病,但无法控制再感染的迅速出现,无法控制血吸虫病的流行,长期、反复、大规模使用吡喹酮化疗有引起血吸虫对吡喹酮产生耐药性的潜在危险。近年来,水利工程大量兴起、气候环境变化与生态环境不断恶化带来的自然灾害,这给血吸虫病防治工作带来了更多的困难。因此需在维护自然环境以及生态平衡基础上控制血吸虫病,人们试图以血吸虫病疫苗的“长效”作用与吡喹酮化疗的“短期”效果相结合来实现控制血吸虫病的目标,已成为科学家为之努力的方向。近年来研究人员已对血吸虫很多分子进行了大量的研究,并从中筛选出了一些具有部分免疫保护作用的疫苗候选分子,在曼氏血吸虫中已有6种候选分子得到了WHO/TDR的认可,如曼氏血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶(Sm GST)、副肌球蛋白(paramyosin,Sm97)、照射减毒抗原5(Irv-5)、曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶(Sm TPI)、23kDa表膜抗原(Sm23)和脂肪酸结合蛋白(FABP,Sm14)等。在日本血吸虫中也相继筛选出了与之相对应的疫苗候选分子以及另一些有效分子,例如日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白(Sj23,减虫率20%-32%)、磷酸丙糖异构酶(SjCTPI,减虫率27.78%)、日本血吸虫14-3-3信号转导蛋白(Sj14-3-3,减虫率34.2%)、脂肪酸结合蛋白(FABP,减虫率24.1%)等,这些分子都能诱导宿主产生部分免疫保护作用,但是诱导的免疫保护力不够理想,因此,人们试图寻找更为有效的血吸虫疫苗候选分子,这已成为当前日本血吸虫研究的重要方向之一。鞘脂激活蛋白样蛋白(Saposin-like protein,SLP)是一大类蛋白家族,他们广泛存在于从原生动物直至哺乳动物的生物体内,并发挥着各种生物学作用;在寄生虫中,如肝片吸虫中的鞘脂激活蛋白样蛋白,重组的肝片吸虫的SLP蛋白(rFhSAP-2)免疫小鼠,可获得了81.2%的减虫率,而且在肝脏和粪便中的减卵率,分别达到73%和83.8%,显示其是一种潜在的疫苗候选分子;华枝睾吸虫的鞘脂激活蛋白样蛋白(clonorin)用于免疫诊断可显示34%的敏感性和99%的特异性;而曼氏血吸虫的鞘脂激活蛋白样蛋白不仅可以被感染小鼠血清识别,还可以被感染人血清识别,也同样显示其具有较好的诊断潜能,但无明显的保护作用。而在日本血吸虫中是否存在该蛋白分子或其功能如何,均未见报导。本研究拟采用生物信息学方法,从日本血吸虫基因库中筛选出日本血吸虫的鞘脂激活蛋白样蛋白(Sj-SLP)基因,并通过基因克隆和原核表达,对其表达产物进行抗原性、免疫原性分析及溶血活性观察,并进一步对该蛋白在日本血吸虫免疫保护作用中的应用价值作出评价。研究内容主要包括:一.日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(Sj-SLP)基因的获得、基因克隆及原核表达根据已知的华枝睾吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(clonorin)的氨基酸序列,采用核酸蛋白比对(tblastn)方法,在日本血吸虫GenBank中寻找与之同源的核酸片段,并通过生物软件DNAStar对其核酸序列进行分析,推测其蛋白结构;再根据SignalP 3.0对蛋白结构进行分析,获得日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(Sj-SLP)基因序列,根据该序列设计引物从日本血吸虫cDNA中扩增Sj-SLP基因,并构建原核表达质粒pET15b-Sj-SLP。将构建成功的重组质粒pET15b-Sj-SLP电击转化入感受态E.coli BL21 (DE3) ,经鉴定后,用异丙基硫代半乳糖(IPTG)(终浓度为1 mmol/L)进行诱导表达,并对表达产物进行纯化,从而获得了纯化的重组蛋白rSj-SLP。为下一步对该蛋白的免疫生物学特性分析提供了基础。二.重组日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(rSj-SLP)的免疫原性、抗原性和溶血活性的研究纯化的重组日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白,经弗氏完全佐剂乳化后(浓度1mg/ml)皮下注射免疫实验兔,剂量为每次1mg/兔,第2和第4周再用经弗氏不完全佐剂乳化的蛋白同法分别加强免疫2次,于末次免疫后2周心脏取血, ELISA法检测抗血清效价。检测结果显示,抗血清中针对rSj-SLP的抗体滴度可达1:12800。通过Western blot法对该重组蛋白的抗原性进行分析,结果显示该蛋白可以被感染日本血吸虫的兔血清识别,而不被正常兔血清识别,表明该重组蛋白具有特异的抗原性。采用健康人的抗凝血,经过充分洗涤处理后,制成红细胞悬液,分别加入PBS,ddH2O和重组蛋白rSj-SLP,观察重组蛋白对红细胞的溶血作用,结果表明,在6h起,该蛋白(500μg/ml)时,出现溶血活性,并随着时间延长作用增强,至62h溶血活性达50%,显示为一种较为迟缓的反应过程,提示该蛋白可能参与日本血吸虫对红细胞的消化过程。三.日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白的免疫保护作用研究60只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,A(自然感染组)、B(弗氏佐剂对照组)、C(ISA206对照组)、D(弗氏佐剂+Sj-SLP蛋白)、E(ISA206+ Sj-SLP蛋白)。每组小鼠分别皮下注射相应的试剂,每隔两周免疫1次,共3次。末次免疫后2周每鼠经腹部皮肤攻击感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴,42d后剖杀,计数检获的成虫数及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血检测血清中IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻击感染前2天取小鼠脾脏制备单个脾细胞,采用ConA和rSj-SLP蛋白刺激脾细胞,培养72h后,用细胞因子检测试剂盒检测培养上清中细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。结果显示,D组(弗氏佐剂+Sj-SLP蛋白)、E组(ISA206+ Sj-SLP蛋白)可分别获得了29.6%和25.9%的减虫率及27.8%和28.5%的减卵率。表明该蛋白可诱导宿主产生对日本血吸虫尾蚴攻击的部分免疫保护作用;这两组间虽佐剂不同,但保护力无显著差异。抗体检测结果显示,D组和E组均可以诱导产生较高水平的特异性IgG以及IgG1和IgG2a,且两者间无明显差别。细胞因子检测结果显示实验组IL-4、IFN-γ均无明显升高,表明该蛋白疫苗诱导宿主产生了以体液免疫为主的免疫应答。该研究提示Sj-SLP似可以作为一种潜在的日本血吸虫候选疫苗分子。

全文目录

一摘要  5-14
  1 中文摘要  5-9
  2 英文摘要  9-14
二前言  14-18
三研究内容  18-54
  第一部分日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白基因的获取、克隆及原核表达  18-37
    材料和方法  18-31
    结果  31-35
    讨论  35-37
  第二部分重组日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(rSj-SLP)的免疫原性、抗原性和溶血活性的研究  37-43
    材料与方法  37-40
    结果  40-41
    讨论  41-43
  第三部分日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白免疫保护作用的研究  43-54
    材料和方法  43-48
    结果  48-51
    讨论  51-54
四结语  54-55
五参考文献  55-59
六致谢  59-60
七综述  60-76
八附录  76-80
  1 本研究中使用的质粒的图谱  76-78
  2 Sj-SLP 基因序列  78-79
  3 本研究中重组质粒测序结果  79-80
  4 硕士在读期间发表论文及参与课题  80

日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白的基因克隆、表达及相关免疫生物学特性的研究

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