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抗AT1受体自身抗体对人体胎盘血管的收缩作用

作　者: 郑荣华
导　师: 刘慧荣
学　校: 山西医科大学
专　业: 生理学
关键词: 先兆子痫血管紧张素Ⅱ1型受体抗体胎盘血管
分类号: R714.244
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景：先兆子痫是孕期特发疾病,由胎盘滋养细胞入侵障碍、螺旋动脉重铸障碍、胎盘血管异常收缩等引起的胎盘灌流量下降是其公认的病理学基础。但引起这一系列胎盘血管病变的原因尚不清楚。近年的研究表明,血管紧张素Ⅱ1型受体细胞外第二环自身抗体(Angiotensin II1 Receptor Autoantibodies, AT 1-AA)可能是先兆子痫的潜在危险因子,其血清浓度的高低与胎盘血流量成负相关,但二者之间是否具有因果关系尚缺乏直接证据。我们的前期研究发现：AT1-AA可通过与AT1受体(AT1R)结合而引发大鼠胸主动脉血管的收缩反应。其他学者以往的研究证实：人体胎盘绒毛膜上存在丰富的AT1R,但是在胎盘血管上是否有AT1R的分布并不十分清楚。如果有,血清中的AT1-AA是否能与胎盘血管上的AT1R结合,从而引起人体胎盘血管的收缩?如果能够证实这一假说,将提供AT1-AA影响胎盘血流量的直接证据。由于可从临床病人血清获得ATl-AA的量极有限,不易满足对AT1-AA功能效应进行系统研究的需要,因此我们采用主动免疫动物的方法诱导产生大量的抗AT1R细胞外第二环抗体(AT1R-Ab)。但是,这种主动免疫产生的抗体是否可作为ATl-AA的替代品,还需要对其进行鉴定。因此本课题设计如下：(1)利用免疫组化方法,检测胎盘血管上AT1R的表达情况；(2)观察从先兆子痫患者血清中提取的AT1-AA对人体胎盘血管的直接作用；(3)制备AT1R-Ab,鉴定其类型及亚类,观察AT1R-Ab对人体胎盘血管功能的影响,并与AT1-AA的作用进行比较,以提供AT1R-Ab可替代AT1-AA进行研究的依据；(4)探讨AT1R-Ab引起人体胎盘血管收缩的可能机制。本研究将为探讨AT1-AA可影响胎盘血流量而参与先兆子痫的发病提供重要的实验依据。目的：1.明确人体胎盘血管上AT1受体的表达情况；2.观察AT1-AA对于正常人体胎盘血管功能的影响；3.鉴定免疫鼠血清中AT1R-Ab的抗体类型和亚类,观察其对人体胎盘血管的作用,并与AT1-AA的功能效应进行比较；4.分析AT1R-Ab引起人体胎盘血管作用的机制。方法：利用免疫组化方法,定位人体胎盘血管上AT1R的表达情况；ELISA法检测先兆子痫患者血清中的AT1-AA,并采用亲和层析法提纯AT1-AA阳性血清总IgGs；以合成的人ATl受体细胞外第二环功能表位肽段(AT1R-ECⅡ,165-191,纯度为95%)为抗原主动免疫雌鼠,使其产生AT1R-Ab,ELISA法鉴定AT1R-Ab的类型和亚类；利用离体胎盘血管环实验,观察AT1-AA对正常人体胎盘血管功能的影响,以及AT1R-Ab对正常人及先兆子痫患者胎盘血管功能的影响。结果：1、AT1受体在人体胎盘血管上具有一定的表达：免疫组化实验结果显示,在胎盘动脉、静脉及血管内皮细胞处均有明显的黄染,说明有AT1R表达,而空白对照组没有黄染情况。(见图1)2、AT1-AA对正常人体胎盘血管具有收缩作用：从先兆子痫患者AT1-AA阳性血清提取获得的IgGs(1mmol／L),对离体正常人胎盘静脉血管产生明显的收缩作用(收缩幅度占同一血管KCl作用的百分比为13.33±0.9%),与空白对照组相比有显著性差异(P<0.01)。该作用能够分别被抗人IgG抗体和AT1R-ECⅡ(AT1受体细胞外第二环)表位肽段所逆转。(见图2、3)3、ATlR-Ab的抗体类型、亚类以及对人胎盘血管的作用与ATl-AA一致：3.1 AT1R-Ab的制备、抗体的类型及亚类鉴定：用合成的AT1R细胞外第二环肽段免疫大鼠,诱导其产生抗AT1R细胞外第二环的抗体(AT1R-Ab),检测免疫前后的血清AT1R-Ab的阳性率,发现第一次加强免疫后已有1只呈抗体阳性,第二次加强免疫阳性率达86%,第三次加强免疫后阳性率达100%。AT1R-Ab含量检测结果发现,免疫4周时已明显升高,8周时达峰值(稀释度1：10时OD值2.89±0.11vs.同期对照组0.44±0.06,P<0.01,见图4)。ELISA法检测结果显示AT1R-Ab为IgG类免疫球蛋白(OD值2.77±0.03 vs.同期对照组0.40±0.04,P<0.01,见图5)。免疫鼠血清中的抗体主要属于IgG2b亚类(OD值0.32±0.04vs.同期对照组OD值为0.08±0.01,P<0.01),尚有较少属IgG2a亚类(OD值0.10±0.01 vs.同期对照组OD值0.07±0.01,P<0.05)。(见图6)3.2 ATlR-Ab与ATl-AA均具有收缩胎盘静脉血管的作用：AT1R-Ab和AT1-AA均能引起正常人胎盘静脉血管收缩。且相同浓度(1mmol／L)的AT1-AA与AT1R-Ab作用于胎盘静脉血管后收缩幅度百分比之间无统计学差异(13.33±0.9%vs.14.00±3.2%,P>0.05)。(见图7)以上结果提示：AT1R-Ab与AT1-AA具有相同的性质和血管收缩功能。4、AT1R-Ab收缩人胎盘血管的作用机制：4.1 AT1R-Ab对胎盘静脉与动脉具有同样的血管收缩作用：1Ommol／L AT1R-Ab能增强胎盘动脉的最大收缩百分比为29.21±3.7%,增强胎盘静脉的最大百分比为21.35±2.8%,两者之间无统计学差异(P>0.05)。(见图8)4.2 AT1R-Ab对人体胎盘的浓度依赖性缩血管作用：0.1、1和10mmol／L的AT1R-Ab可浓度依赖性使人体胎盘血管收缩,最大收缩百分比分别为2.73±1.1%、14.00±3.2%和33.30±5.6%,各浓度之间引起的收缩百分比均具有统计学差异(P<0.01)(见图9)。1mmol／L的AT1R-ECⅡ预孵血管后能有效逆转AT1R-Ab的缩血管作用。(见图10)4.3 ATl受体而非AT2受体介导AT1R-Ab的缩血管作用1mmol／L的losartan(AT1受体拮抗剂)可有效阻断AT1R-Ab的缩血管作用(14.00±3.2%vs.-6.33±0.9%,P<0.05)；而lmmol／L的PD123319(AT2受体拮抗剂)未能阻断AT1R-Ab的缩血管作用(14.00±3.2%vs.13.50±3.3%,P>0.05)。(见图11)4.4 ATlR-Ab具有类似血管紧张素Ⅱ但持续时间较长的收缩胎盘血管作用：AT1R-Ab对胎盘血管的收缩作用与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)类似,且1mmol／L的losartan可有效阻断AngⅡ的缩血管作用(-2.60±0.2% vs 8.11±1.6%,P<0.05)；而1mmol／L的PD123319也未能阻断AngⅡ的缩血管作用(6.98±1.7% vs.8.11±1.6%,P>0.05)。(见图12)值得注意的是：与AngⅡ相比,AT1R-Ab的收缩胎盘血管的持续时间明显延长。AT1R-Ab作用时间约33.60±3.1分钟,仍维持于高峰状态,而AnglⅡ平均持续约2.93±0.3分钟,收缩效应就开始处于下滑阶段。显而易见,AT1R-Ab引起胎盘血管持续收缩的时间明显长于血管紧张素Ⅱ作用的时间,具有不脱敏的趋势。(见图13)4.5 ATlR-Ab对先兆子痫患者的胎盘血管具有浓度依赖性收缩作用：0.1、1与10mmol／L的AT1R-Ab引起的人体胎盘血管最大收缩幅度百分比分别为1.74±0.3%、5.58±1.4%和13.73±2.5%,各浓度的收缩百分比之间都具有统计学差异(P<0.01)。(见图14)结论：1、AT1R在人体胎盘血管上有一定的表达；2、先兆子痫患者的AT1-AA具有直接收缩正常人胎盘血管的作用；3、AT1R-Ab可以替代AT1-AA作为实验工具：4、AT1R-Ab能够直接导致正常以及子痫前期患者的胎盘血管浓度依赖性收缩,并且这种收缩作用是通过与AT1受体结合而实现的。AT1R-Ab的缩血管作用和血管紧张素Ⅱ的作用类似,但作用时间较长,具有不脱敏趋势。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
材料和方法  15-22
结果  22-24
讨论  24-27
结论  27-28
参考文献  28-32
图表  32-47
译述  47-67
个人简介  67-69
致谢  69

抗AT1受体自身抗体对人体胎盘血管的收缩作用

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