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BVDV-2分离株XJ-04全基因组测序和抗BVDV单克隆抗体制备及初步应用

作　者: 林燕清
导　师: 朱国强
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: BVDV-2 XJ-04 基因组测序系统进化树双抗体夹心ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

牛病毒性腹泻病(Bovine viral disease, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起牛的一种多临床症状的传染病,目前呈世界性分布,给养牛业造成巨大的经济损失。BVDV分为基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。自20世纪80年代末,BVDV-2首次分离于加拿大和美国爆发急性的BVD中。BVDV-2主要引起腹泻,免疫耐受与持续性感染,先天性缺陷,母畜流产、产死胎和畸形胎等;高毒力的BVDV-2还能引起血小板减少症和出血综合症。BVDV-1在我国牛群中流行普遍,2009年BVDV-2首次在我国分离报道。因此,本研究将集中如下两部分:一、制备抗BVDV单克隆抗体,基于生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA检测方法;二、对分离鉴定的BVDV-2 XJ-04株全基因组序列进行测序分析及基因分型。上述研究旨在为我国牛病毒性腹泻病的分子流行病学研究和诊断方法奠定基础。研究一:采用分段RT-PCR方法扩增BVDV-2 XJ-04株的18个片段,分别为A-Q、5’和3’-UTR部分序列。除了5’和3’-UTR部分序列外,内侧的17个基因片段末端相互重叠;5’和3’-UTR部分序列是在RNA连接酶作用下将RNA5’和3’端自我连接后进行RT-PCR扩增。将各序列进行拼接后成功获得了BVDV-2 XJ-04株的全长为12,284bp的全基因组序列,并在GenBank中进行注册,登录号为FJ527854。通过5’-UTR及全基因组序列进化树分析,并结合自我裂解酶(Npro)及结构蛋白(C、Erns、E1、E2)与标准株NADL(BVDV-1)和890(BVDV-2)进行核苷酸及氨基酸序列同源性比较分析,结果表明XJ-04与890、NewYork93的亲缘关系最近,归入BVDV-2a亚型。研究二:将经PEG浓缩、蔗糖垫底纯化的890毒株(BVDV-2)作为制备单克隆抗体的免疫原;免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,以pET28a-BE2的原核表达产物BE2为检测抗原进行间接ELISA筛选,得到1株分泌性能稳定、抗体分子类为IgG、腹水ELISA滴度为1:216的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,命名为3F9。3F9对猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、1型牛疱疹病毒(Bovine herpes virus-1, BHV-1)、牛轮状病毒(Bovine rota virus, BRV)均无交叉反应,显示3F9具有良好的特异性。利用该单克隆抗体的高特异性以及Biotin-avidin system(BAS)系统的灵敏性,设计了一种灵敏度高、特异性强的检测BVDV的双抗体夹心ELISA方法,单克隆抗体IgM为捕获抗体,biotin标记的3F9作为第二抗体。方阵滴定实验确定捕获抗体最佳工作浓度为2μg/mL,Biotin-3F9工作效价为60ng/mL,BE2最低检出量为84ng/mL。建立双抗体夹心ELISA方法检测35份病牛血清样本,13份为阳性;与RT-PCR的符合率达到94.29%;表明本研究所建立的BAS-ELISA方法可用于BVDV感染的临床诊断。这为BVDV的免疫学研究和临床诊断提供技术基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
符号说明  11-12
文献综述  12-29
  1 病原学  12-13
    1.1 发现  12-13
    1.2 主要特征  13
  2 BVDV 分子生物学研究进展  13-19
    2.1 BVDV 基因组结构  13-14
    2.2 BVDV 蛋白功能研究  14-19
  3 BVDV 分型及分子流行病学研究进展  19-25
    3.1 BVDV 分型  19-21
    3.2 国外BVDV 流行状况  21-22
    3.3 国内BVDV 流行情况  22-24
    3.4 BVDV 感染其他动物  24-25
  4 牛病毒性腹泻病毒检测技术研究进展  25-28
    4.1 聚合酶链式反应（PCR）技术  25-26
    4.2 病毒分离与免疫荧光技术  26
    4.3 电镜技术  26
    4.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）  26-27
    4.5 免疫过氧化物酶技术  27
    4.6 血清中和试验（Serum neutralization test，SNT）  27
    4.7 琼脂扩散试验(Agar gel diffusion test，AGDT)  27-28
  5 防制  28-29
研究一、牛病毒性腹泻病毒 XJ-04 株基因组序列的测定与分析  29-45
  摘要  29
  Abstract  29-30
  1 材料  30-31
    1.1 毒株、细胞和菌株  30
    1.2 主要试剂  30-31
    1.3 主要仪器  31
  2 方法  31-38
    2.1 病毒的传代及浓缩  31
    2.2 病毒RNA 的提取  31-32
    2.3 反转录（RT）  32
    2.4 病毒基因组内侧序列的测定  32-37
    2.5 病毒5’-3’-UTR 部分序列的测定  37-38
    2.6 基因序列的拼接与分析  38
  3 结果  38-42
    3.1 基因组序列的RT-PCR 扩增  38-39
    3.2 基因组全序列测定结果及同源性分析  39-41
    3.3 结构蛋白的糖基化位点分析  41-42
  4 讨论  42-45
    4.1 基因组序列测定  42-43
    4.2 基因组序列分析  43-45
研究二、抗 BVDV 单克隆抗体的制备及初步应用  45-59
  摘要  45
  Abstract  45-47
  1 材料  47-48
    1.1 病毒、菌株和蛋白  47
    1.2 实验动物和细胞系  47
    1.3 细胞培养基及主要试剂  47
    1.4 仪器设备  47-48
  2 方法  48-53
    2.1 抗原的制备  48-49
    2.2 小鼠的免疫  49
    2.3 骨髓瘤细胞SP2/0 的制备  49
    2.4 饲养细胞的制备  49
    2.5 脾淋巴细胞的准备  49-50
    2.6 细胞的融合  50
    2.7 杂交瘤细胞株的筛选  50-51
    2.8 杂交瘤细胞的克隆化及建株  51
    2.9 单克隆抗体制备和效价测定  51-52
    2.10 Western-blotting  52
    2.11 单克隆抗体的稳定性检测  52
    2.12 单克隆抗体的纯化  52
    2.13 单抗的生物素标记及效价的测定  52
    2.14 双抗体夹心ELISA 方法的建立  52-53
    2.15 双抗体夹心ELISA 方法特异性的检测  53
    2.16 双抗体夹心ELISA 方法临界值的确定  53
    2.17 双抗体夹心ELISA 方法临床应用  53
  3 结果  53-57
    3.1 抗原的制备  53-54
    3.2 细胞的融合及筛选  54-55
    3.3 单克隆抗体的制备和效价测定  55
    3.4 Western-blotting 结果  55-56
    3.5 单克隆抗体稳定性检测  56
    3.6 单克隆抗体的纯化  56
    3.7 IgG 的biotin 标记  56
    3.8 双抗体夹心ELISA 方法的建立  56
    3.9 双抗体夹心ELISA 方法的特异性  56-57
    3.10 双抗体夹心ELISA 方法临界值的确定  57
    3.11 双抗体夹心ELISA 方法的应用  57
  4 讨论  57-59
全文总结  59-60
文献  60-69
致谢  69-70
攻读学位期间发表的学术论文目录  70

BVDV-2分离株XJ-04全基因组测序和抗BVDV单克隆抗体制备及初步应用

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