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肝特异性条件性可调控的Cre重组酶转基因小鼠品系的建立和肺癌的methylome研究

作　者: 周小羽
导　师: 朱景德
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: 肝特异性 Cre重组酶转基因小鼠条件性肺癌 DNA甲基化生物标志物 MBD 重亚硫酸盐基因组测序法
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肝特异性/条件性可调控性的Cre/LoxP位点特异性重组酶系统转基因小鼠,是研究正常发育中和肝癌发病过程中肝细胞谱系in vivo基因功能的必要前提。就肝细胞特异性而言,已有以白蛋白启动子或LAP启动子驱动Cre酶基因的肝细胞特异性剔除小鼠模型,但这类小鼠模型尚无法有效地避免渗漏表达及发育相关基因被敲除引起的胚胎致死等缺点。因此,本项目将联合运用肝特异性启动子LAP控制的tet-off诱导系统在转录水平及Tamoxifen激活系统对Cre重组酶活性在蛋白相互作用水平上尝试建立高效的肝特异性,条件性可调控Cre-ERT2转基因小鼠。为此,我们将前期构建好的转录和转录后水平双重调控的肝特异性表达Cre重组酶的载体导入小鼠ES细胞,得到15只可稳定遗传该基因系统的转基因小鼠。将此转基因小鼠繁殖,并将其Cre阳性的后代与flox-LacZ(ROSA26)报告小鼠杂交,通过RT-PCR和LacZ染色的方法检测转基因小鼠的Cre重组酶活性的肝特异性、Dox和Tamoxifen的可调控性。通过子代基因型和表型的研究,我们可能获得了两只肾特异性表达Cre-ERT2的小鼠品系,但并没有获得肝特异性的剔除小鼠。这可能与LAP启动子的肝细胞特异性有限和转基因插入位点不确定性有关。为此,我们正在用白蛋白基因启动子替代LAP基因启动子建立的Cre表达双重调控系统,旨以最终获得肝特异性条件性双重控制的Cre-ERT2小鼠,为肝细胞特异性基因功能研究所需的肝细胞特异性条件性基因剔除提供必要的小鼠模型。肺癌是一种发病率与死亡率位于疾病谱前列且发病率逐年递增的恶性肿瘤之一,其五年存活率仅为15%,全世界每年因肺癌死亡的人数超过100万。对肺癌早期的成功筛查和诊断对提高肺癌病人生存率具有极大的帮助。影像技术和细胞筛选策略已经在很多年前被应用到肺癌的早期诊断,但是在降低肿瘤病人的死亡率上效果并不理想。为了获得更好的前期诊断、临床管理和术后预测,我们需要对遗传学和表观遗传学机理在恶性肿瘤发生和发展中所起到的重要作用进行更深入的研究。最近的研究发现,抑癌基因启动子区域的异常甲基化作为分子诊断标志物,其灵敏度和可操作性都优于目前已知的分子生物标志物。因此,寻找与肺癌相关的启动子区域高甲基化并导致其失活的抑癌基因,对于肺癌发病机理和研究、病人的治疗方式和预后检测都有积极的意义。我们利用MBD亲和柱层析技术和DNA片段CpG甲基化程度富集高甲基化片段的技术(Methyl-capture)分别建立了肺癌细胞系和正常肺组织的全基因组甲基化DNA文库,通过高通量的Solexa测序平台,希望发现一批有意义的异常甲基化的靶点,并通过重亚硫酸盐基因组测序法和甲基化特异性PCR的方法对其中部分靶点的DNA甲基化状态进行了复核。我们已有结果表明：1、我们的平台在发现肿瘤状态特异性DNA甲基化异常的通量和准确度方面有着很高的标准；2、我们所发现的肺癌特异性的DNA甲基化状态遗传靶点能对我们进一步的机制研究和发展以DNA甲基化分析为基础的肺癌诊断方法提供大量的信息。

全文目录

第一部分肝特异性条件性可调控的Cre重组酶转基因小鼠品系建立  4-33
  中文摘要  4-5
  英文摘要  5-6
  前言  6-10
  材料和方法  10-21
  结果  21-27
  讨论  27-33
第二部分绘制肺癌/正常肺组织的methylome,旨以发现肺癌特异性DNA甲基化靶点  33-63
  中文摘要  34-35
  英文摘要  35-36
  前言  36-39
  材料和方法  39-51
  结果  51-61
  讨论  61-63
参考文献  63-67
综述 DNA甲基化及其在癌症研究中的意义  67-78
致谢  78-80

肝特异性条件性可调控的Cre重组酶转基因小鼠品系的建立和肺癌的methylome研究

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