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海南微藻种质资源收集、鉴定及高含油量微藻的筛选

作　者: 马帅
导　师: 张家明
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 微藻海南种质资源分离鉴定尼罗红粗脂肪提取脂肪酸成分
分类号: Q94-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着矿物能源消耗和全球气候问题的日益严重,研究、开发和利用可再生能源是人类社会、经济发展的大势所趋。生物质能作为可再生能源的重要组成部分,越来越受到世界各国的重视。微藻是一种具有光合作用效率高、环境适应能力强、油脂含量高、生物量大、生长周期短、易培养等众多优点的新型生物质能源。海南省全年暖热,雨量充沛,水域资源丰富,海域广阔,藻类资源极为丰富,具有很大的潜在价值。本研究旨在通过试验,收集得到一些海南特有的藻类资源,以丰富我国的藻类资源,建立一套筛选有较大研究价值、经济价值微藻的有效方法,并筛选高生物量、含油量藻株,建立能源微藻核心种质资源。为藻类的开发利用、生物质能源的深入研究奠定基础。采用水滴法、稀释法、平板法等3种微藻的分离方法,对11个采样点的样品进行藻株的分离、纯化,得到87株微藻,其中海水藻34株,淡水藻53株。并对分离得到的部分微藻进行细胞形态学鉴定,初步鉴定了盘星藻(Pediastrum biraditum)、二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)、小空星藻(Coelastrum microporum)等10余个不同的藻种。对编号DWZ-8的藻株进行了较深入的研究,发现DWZ-8以似亲孢子生殖方式繁殖,叶绿体分裂方式属于独特的劈裂式分裂,仅有一个1.4-2.1μm的蛋白核,类囊体呈管状,方向多样,有平行与切面的也有垂直与切面的。采用分子生物学的方法对其进行鉴定发现DWZ-8核编码的18S rDNA长2500个碱基对,含有两个GI内含子,其叶绿体编码的16S rDNA长1488 bp,无内含子；与亲缘关系较近的藻种进行比较,差异均较大。综合分析DWZ-8各方面的鉴定指标均与海南橡胶藻(Heveochlorella hainangensis)最为接近,笔者初步认为DWZ-8为橡胶藻属的一个新种(Heveochlorella species)。本试验通过对与微藻材料Hhw中中性脂尼罗红染色的荧光强度测定相关的各项指标进行梯度试验。得到尼罗红荧光分光光度法测脂的最优条件为：EX 485nm、微藻细胞密度OD690=0.858、DMSO的加入量250μl／ml、染色2min、NR=1.2μg／ml。采用该优化条件对其他微藻进行染色测定其中性脂含量均可行。通过试验比较得到了一种适合实验室使用的从微藻中快速提取粗脂肪的方法,即改良的酸水解法。同时建立了利用尼罗红染色显微观察与直接提取法相结合的筛选高含油量微藻的平台,并筛选得到一些含油量较高的藻株。对2个藻株的脂肪酸成分进行分析发现,橡胶藻脂肪酸较为单纯,主要由亚油酸、油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、亚麻酸等6种组成。其中不饱和脂肪酸50.4%,16-18碳脂肪酸占脂肪酸总量的96%,适于加工生物柴油；Hhw的脂肪酸主要由亚油酸、油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、亚麻酸、花生四烯酸、EPA等9种脂肪酸组成不饱和脂肪酸40.58%,16-18碳脂肪酸占脂肪酸总量的86.27%,适于加工生物柴油。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 前言  10-23
  1.1 藻类的概述  10-11
  1.2 藻类的演化及系统分类  11-13
  1.3 微藻的研究现状  13-17
    1.3.1 微藻种质资源研究  13-14
    1.3.2 微藻的商业化利用现状  14
    1.3.3 高脂微藻的筛选  14-15
    1.3.4 微藻作为生物能源的开发  15
    1.3.5 微藻规模化养殖中存在的主要问题  15-16
    1.3.6 育种技术在微藻中的应用  16-17
  1.4 18S rRNA在系统进化研究中的作用  17-18
  1.5 微藻脂肪酸的研究  18-19
    1.5.1 微藻脂肪酸的提取工艺  18
    1.5.2 微藻脂肪酸成分分析  18-19
  1.6 尼罗红在微藻研究中使用  19-20
  1.7 本试验研究的目的意义  20-22
  1.8 本研究技术路线  22-23
2 材料与方法  23-39
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 样品的采集  23-24
    2.1.2 菌株和质粒  24
  2.2 主要仪器和试剂  24-25
    2.2.1 主要仪器  24
    2.2.2 主要试剂  24-25
  2.3 常用培养基的配置  25-28
  2.4 实验方法  28-39
    2.4.1 藻株的分离、纯化和培养  28-29
      2.4.1.1 藻株的分离、纯化  28
      2.4.1.2 藻株的培养和保存  28-29
    2.4.2 藻株的形态学观察和鉴定  29-31
      2.4.2.1 光学显微镜观察和鉴定  29
      2.4.2.2 电子透射显微镜观察和鉴定  29-31
    2.4.3 微藻分子生物学鉴定  31-35
      2.4.3.1 微藻基因组DNA的提取  31-32
      2.4.3.2 微藻18S rDNA、16S rDNA基因的PCR扩增和核酸序列测定  32-35
      2.4.3.3 核酸序列数据的分析和系统树构建  35
    2.4.4 高含油量微藻的筛选  35-38
      2.4.4.1 利用尼罗红染色法测定微藻的含油量  35-37
      2.4.4.2 直接提取法快速测定微藻含油量  37
      2.4.4.3 尼罗红染色与直接提取相结合筛选高含油量微藻  37-38
    2.4.5 微藻脂肪酸成分分析  38-39
      2.4.5.1 样品处理  38
      2.4.5.2 脂肪酸的组成和含量分析  38-39
3 结果与分析  39-62
  3.1 微藻种质资源的收集  39
  3.2 微藻基因组DNA的提取  39-41
  3.3 微藻的分类与鉴定  41-43
    3.3.1 HKJ-1的种属鉴定  41
    3.3.2 HKJ-2的种属鉴定  41
    3.3.3 HKS-8的种属鉴定  41
    3.3.4 HKS-7的种属鉴定  41-42
    3.3.5 HKS-1的种属鉴定  42
    3.3.6 HKS-9的种属鉴定  42
    3.3.7 HD-1的种属鉴定  42-43
    3.3.8 HKS-5的种属鉴定  43
  3.4 一株新种(DWZ-8)的分离、纯化与鉴定  43-54
    3.4.1 DWZ-8的细胞形态学观察与鉴定  43-48
      3.4.1.1 DWZ-8的分离培养及光学显微镜观察  43-47
      3.4.1.2 DWZ-8的电子透射显微镜观察  47-48
    3.4.2 DWZ-8的18S rDNA的结构及其与近缘种的比较  48-51
    3.4.3 DWZ-8的16S rDNA的结构及其与近缘种的比较  51-52
    3.4.4 DWZ-8的系统发育分析  52-54
  3.5 高含油量微藻的筛选  54-60
    3.5.1 利用尼罗红染色法筛选高含油量微藻  54-58
      3.5.1.1 尼罗红荧光染料用量的确定  54
      3.5.1.2 尼罗红荧光染料染色时间的确定  54-55
      3.5.1.3 试验材料的细胞密度确定  55
      3.5.1.4 染色前二甲基亚砜添加量的确定  55-56
      3.5.1.5 尼罗红染色的荧光显微镜观察  56-58
    3.5.2 从微藻中提取粗脂的方法比较  58-60
      3.5.2.1 三株微藻的生物量  58
      3.5.2.2 三株微藻的粗脂含量  58-59
      3.5.2.3 抽提时间的比较  59
      3.5.2.4 抽提方法的比较  59-60
  3.6 微藻脂肪酸成分分析  60-62
    3.6.1 海南橡胶藻的脂肪酸成分分析  60-61
    3.6.2 藻株Hhw的脂肪酸成分分析  61-62
4 讨论  62-65
  4.1 关于海南微藻种质资源的收集及后续资源库建立的研究  62
  4.2 细胞生物学与分子生物学结合对微藻种属鉴定的必要性  62
  4.3 关于电子透射显微镜微藻样品制备  62-63
  4.4 关于高含油量微藻筛选  63
  4.5 关于微藻作为生物质能源的开发  63-64
  4.6 关于微藻脂肪酸的成分  64-65
5 结论  65-66
附录1:一些藻类的显微照片  66-68
附录2:DWZ-8的18S rDNA、16S rDNA序列  68-69
附录3:部分试剂的配制  69-70
参考文献  70-77
致谢  77

海南微藻种质资源收集、鉴定及高含油量微藻的筛选

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