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番木瓜eIF4E和eIFiso4E的克隆及其与PRSV-VPg互作研究

作　者: 吴金燕
导　师: 周鹏
学　校: 海南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 番木瓜环斑病毒 Cp-eIF4E Cp-eIFiso4E GAL4系统双分子荧光互补技术蛋白互作
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus, PRSV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒,是制约番木瓜种植业和加工产业的主要因素。在马铃薯Y病毒基因组5’端,存在病毒基因组连接蛋白(virus genome-linked protein, VPg), VPg可在病毒的感染周期中干预几个步骤,包括病毒RNA的复制,病毒细胞间移动和长距离移动。真核翻译起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)能够与mRNA的帽子结构或帽子同系物特异地交叉结合,在蛋白质合成的起始中起关键作用。通常情况下,mRNA是通过5’帽子结构与eIF4E结合,但马铃薯Y病毒属病毒基因组的5’端没有帽子结构,而是共价结合VPg蛋白。研究发现,病毒基因组连接蛋白VPg与eIF4E的结合在多种马铃薯Y病毒属病毒侵染植物过程中起关键作用,通过突变eIF4E的关键位点能影响病毒-植物的互作,并能介导植物对病毒的抗性。eIF4E是一个多基因家族,在植物中eIF4E家族成员包括eIF4E及其异构体eIFiso4E,这两个因子在翻译起始过程的作用相同,但在结合m7GpppN和其他帽类似物的能力上存在差异。同一宿主植物中,马铃薯Y病毒利用eIF4E及其异构体的能力存在差异,而番木瓜eIF4E和eIFiso4E与PRSV-VPg结合情况尚未报道。因此本研究通过克隆番木瓜Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因,利用GAL4酵母双杂交系统和双分子荧光互补技术探究PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E的互作情况,为以eIF4E为靶点进行抗PRSV研究奠定基础。以番木瓜嫩叶为材料提取RNA,通过RT-PCR、5’-Full RACE和3’-Full RACE获得了Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因编码区全长,Cp-eIF4E全长1185bp,其中开放阅读框为708 bp,编码236个氨基酸；Cp-eIFiso4E全长995bp,其中开放阅读框为618 bp,编码206个氨基酸。以本实验室保存PRSV海南分离物为模板,通过PCR扩增获得PRSV-VPg基因,开放阅读框为561 bp,编码187个氨基酸。利用细胞核内酵母双杂交—GAL4系统研究PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E的互作情况,分别构建含PRSV-VPg基因的诱饵载体和含Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因的激活域载体,并对其进行自激活和毒性检测。用醋酸锂转化法将其转入酵母菌株YRG-2中,通过营养缺陷筛选及β-半乳糖苷酶筛选。结果表明：PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E均存在不同程度的互作。为进一步研究PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E的互作情况,采用双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFc)对其进行互作研究。分别构建PRSV-VPg基因的BiFc-pSATN-nEYFP载体和含Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E基因的BiFc-pSATN-cEYFP载体。通过基因枪轰击洋葱表皮细胞,培养12-16h。荧光显微镜下观察发现PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E均在植物细胞中发生互作,互作结果与GAL4系统研究结果一致。对这种互作作用的推测,最有可能的是PRSV-VPg与Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E结合可推动病毒蛋白的翻译起始和积累。本研究结果对揭示PRSV致病机理奠定了理论基础,同时亦为以eIF4E为靶点进行番木瓜抗PRSV研究提供了实践基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-12
1. 引言  12-27
  1.1 番木瓜环斑病毒概述  13-16
    1.1.1 症状表现  13
    1.1.2 PRSV株系、寄主范围和传播途径  13-14
    1.1.3 马铃薯Y病毒属基因组结构和功能研究  14
    1.1.4 番木瓜抗PRSV基因工程研究  14-16
  1.2 真核翻译起始因子4E的结构、功能和调节  16-17
    1.2.1 真核翻译起始因子4E的结构  16
    1.2.2 真核翻译起始因子4E的功能  16
    1.2.3 真核翻译起始因子4E的调节  16-17
  1.3 植物真核翻译起始因子4E的研究进展  17-22
    1.3.1 真核翻译起始因子4E与蛋白质翻译起始  17-18
    1.3.2 eIF4E参与马铃薯Y病毒繁殖的可能机制  18-19
    1.3.3 马铃薯Y病毒可选择性地利用eIF4E基因家族的成员  19-20
    1.3.4 植物eIF4E与病毒互作的研究  20
    1.3.5 eIF4E在植物抗病上的研究  20-22
  1.4 本文研究蛋白质相互作用的方法  22-24
    1.4.1 细胞核酵母双杂交  22-23
    1.4.2 双分子荧光互补技术  23-24
  1.5 本研究的目的意义和技术路线  24-27
    1.5.1 目的意义  24-26
    1.5.2 技术路线  26-27
2 材料与方法  27-51
  2.1 材料与试剂  27-33
    2.1.1 植物材料  27
    2.1.2 主要的酶和生化试剂  27
    2.1.3 菌株和质粒  27-28
    2.1.4 表达载体及克隆载体图  28-30
    2.1.5 培养基  30-33
    2.1.6 主要仪器设备  33
  2.2 番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆  33-39
    2.2.1 番木瓜RNA提取  33-34
      2.2.1.1 试验器材的处理  33-34
      2.2.1.2 从组织中提取总RNA  34
    2.2.2 双链cDNA合成  34-35
    2.2.3 引物设计和RT-PCR反应  35-36
    2.2.4 PCR扩增程序  36
    2.2.5 PCR产物回收与鉴定  36-39
      2.2.5.1 PCR产物回收  36-37
      2.2.5.2 PCR回收产物与克隆载体pMD18-T Vector的连接  37
      2.2.5.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  37-38
      2.2.5.4 连接产物转化感受态细胞  38
      2.2.5.5 重组质粒的菌液PCR鉴定  38
      2.2.5.6 序列鉴定与分析  38-39
  2.3 酵母双杂交鉴定PRSV-VPg与番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作  39-47
    2.3.1 酵母诱饵表达载体pBD-GAL4 Cam-VPg的构建及鉴定  39-41
      2.3.1.1 VPg基因加入相应的酶切位点  39
      2.3.1.2 重组质粒的提取(采用TIANGEN小提中量试剂盒)  39-40
      2.3.1.3 重组质粒的酶切鉴定  40
      2.3.1.4 诱饵载体pBD-GAL4 Cam的制备  40
      2.3.1.5 VPg基因与诱饵载体pBD-GALA-Cam的连接  40-41
      2.3.1.6 连接产物的转化及鉴定  41
    2.3.2 酵母激活域表达载体pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E的构建及鉴定  41-42
      2.3.2.1 番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因加入相应的酶切位点  41-42
      2.3.2.2 重组质粒的提取  42
      2.3.2.3 重组质粒的酶切鉴定  42
      2.3.2.4 激活域载体pAD-GAL4-2.1的制备  42
      2.3.2.5 番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因与激活域载体pAD-GAL4-Cam的连接  42
      2.3.2.6 连接产物的转化及鉴定  42
    2.3.3 诱饵质粒的转化及毒性与自激活检测  42-44
      2.3.3.1 酵母菌株表型鉴定及酵母感受态细胞的制备  43
        2.3.3.1.1 酵母菌株表型鉴定  43
        2.3.3.1.2 酵母感受态细胞的制备  43
      2.3.3.2 分别转化重组子pBD-GAL4 Cam-VPg和空载体pBD-GAL4 Cam(对照)入酵母YRG-2感受态  43-44
      2.3.3.3 诱饵表达质粒的毒性检测  44
      2.3.3.4 诱饵质粒表达的融合蛋白自激活检测  44
    2.3.4 激活域载体转化酵母YRG-2及毒性与自激活检测  44-45
      2.3.4.1 酵母感受态细胞的制备  44-45
      2.3.4.2 分别转化重组子pAD-GAL4-2.1-eIF4E/eIFiso4E、空载体pAD-GAL4-2.1(阴性对照)及pGAL4(阳性对照)入酵母YRG-2感受态  45
      2.3.4.3 激活域表达质粒的毒性检测  45
      2.3.4.4 激活域表达质粒自激活检测  45
    2.3.5 酵母双杂交  45-46
      2.3.5.1 含有诱饵质粒的酵母感受态细胞的制备  45
      2.3.5.2 转化激活域重组子入含有诱饵质粒的酵母感受态细胞  45-46
    2.3.6 酵母克隆的初步鉴定  46-47
      2.3.6.1 β-半乳糖苷酶影印法筛选阳性克隆  46
      2.3.6.2 阳性酵母质粒的提取、回转大肠杆菌验证  46-47
      2.3.6.3 阳性克隆的测序  47
  2.4 双分子荧光互补技术验证鉴定PRSV-VPg与番木瓜eIF4E和eIFiso4E的互作  47-51
    2.4.1 BiFc载体的构建  47-50
      2.4.1.1 添加酶切位点  47-48
      2.4.1.2 酶切反应体系  48-49
      2.4.1.3 BiFc表达载体的构建与鉴定  49-50
      2.4.1.4 重组质粒的大量提取(利用TIANGEN的高纯度大提试剂盒)  50
    2.4.2 基因枪转化  50-51
      2.4.2.1 金粉的处理  50
      2.4.2.2 基因枪子弹制备  50-51
      2.4.2.3 轰击  51
      2.4.2.4 洋葱表皮预处理  51
      2.4.2.5 荧光显微镜下观察  51
3 结果与分析  51-64
  3.1 番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的克隆  51-56
    3.1.1 番木瓜果实总RNA的提取  51-52
    3.1.2 番木瓜eIF4E基因全长序列的克隆  52-53
    3.1.3 番木瓜eIFiso4E基因全长序列的克隆  53
    3.1.4 Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E结构分析  53-56
  3.2 酵母双杂交互作结果  56-60
    3.2.1 酵母表达载体的构建  56-58
      3.2.1.1 酶切位点引入PRSV-VPg、Cp-eIF4E及Cp-eIFiso4E  56-57
      3.2.1.2 诱饵载体和激活域载体的构建和鉴定  57-58
    3.2.2 酵母菌株YRG-2表型鉴定  58
    3.2.3 诱饵载体转化酵母YRG-2毒性及自激活检测  58
    3.2.4 激活域载体转化酵母YRG-2毒性及自激活检测  58-59
    3.2.5 酵母双杂交筛选结果  59-60
      3.2.5.1 营养缺陷型筛选及LacZ活性筛选  59-60
      3.2.5.2 回转验证及测序  60
  3.3 双分子荧光互补技术验证PRSV-VPg与Cp-EIF4E和Cp-eIFiso4E的互作结果  60-64
    3.3.1 BiFc载体的构建与鉴定  60-62
    3.3.2 基因枪转化结果  62-64
4 讨论  64-67
  4.1 Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上与mRNA帽子及4G作用的活性部位氨基酸与其它eIF4E和eIFiso4E的高度保守  64
  4.2 已知抗病位点在Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E上的定位  64-65
  4.3 马铃薯Y病毒VPg利用植物eIF4E及eIFiso4E的情况  65
  4.4 GAL4酵母双杂交系统和BIFC同时研究PRSV-VPg与CP-eIF4E和CP-eIFiso4E的互作情况  65-66
  4.5 以番木瓜eIF4E为靶点抗PRSV的可行性  66-67
5 主要结论及进一步研究建议  67
  5.1 主要结论  67
  5.2 进一步研究建议  67
参考文献  67-75
附录  75-76
致谢  76

番木瓜eIF4E和eIFiso4E的克隆及其与PRSV-VPg互作研究

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