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铂类及砷类抗肿瘤药物与蛋白质的作用机理研究

作　者: 赵林泓
导　师: 刘扬中
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物无机化学
关键词: 顺铂线粒体 Cox17 谷胱甘肽亚砷酸盐锌指蛋白
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

铂类和亚砷类药物是无机抗肿瘤药物中十分重要和典型的两类。铂和亚砷药物的生理学作用机制都与含硫蛋白质的相互作用密切相关。在这些蛋白中,铜转运蛋白在铂类药物的细胞摄取、转运、排出以及药效上发挥重要作用,而锌指蛋白则是亚砷化合物的极为重要的直接靶点。本论文研究了铂化合物与铜伴侣蛋白Coxl7,以及亚砷酸钠与多种锌指蛋白的相互作用机制,并且研究了一些重要的细胞环境因素对这些相互作用的影响。第一章是对铂类药物和亚砷化合物的生理学作用机制进行综述。主要涉及铂类药物与DNA靶点的作用以及诱导细胞凋亡的机制；铂类药物的多靶点；铂类药物与铜转运蛋白的关系；亚砷的致癌性和用于癌症治疗的双重功能,以及锌指蛋白与这两种机制的关联。第二章研究了顺铂和人铜伴侣蛋白Cox17的体外和体内的相互作用。我们利用大肠杆菌体系进行了Cox17蛋白的表达,利用Ni-NTA柱和凝胶过滤色谱进行了蛋白的纯化。用紫外-可见光谱、高效液相色谱、电感耦合等离子体质谱和电喷雾质谱的方法研究了Cox172s-s和顺铂的相互作用,同时实验中使用了氧化态的Cox173s-s作为对照,以研究铜结合位点在Cox17与顺铂结合中的功能。结果证实,Cox17蛋白的铜结合位点,也是顺铂的主要结合位点,顺铂通过与铜位点的自由半胱氨酸残基配位形成Pt-S键结合到Cox17上。而且Pt-S键的形成活化了顺铂的其它配位位点,使得顺铂的原始配体很容易离去,而形成四个原始配体都被取代的裸铂加合物{Pt}-COx17。此外,细胞实验证明,Cox17作为一个铜伴侣蛋白,参与顺铂向线粒体的运输。此结果是对铜转运蛋白参与顺铂细胞传递过程的结论的进一步证实和补充。第三章研究了三种典型铂化合物顺铂、反铂、奥沙利铂与Cox172s-s的作用机制,以及关键的生物分子谷胱甘肽(GSH)对三种不同铂化合物与Cox172s-s作用机制的影响。结果显示,三种不同的铂化合物都能够和Cox172s-s铜位点的自由半胱氨酸结合。反铂和奥沙利铂与Cox17的结合方式与顺铂不同,反铂脱去两个原始氯离子而与Cox17形成单一的单铂加合物{Pt(NH3)2}-COx17和双铂加合物{Pt2(NH3)4}-Cox17,奥沙利铂脱去原始草酸根而与Cox17形成单一的单铂加合物{Pt(DACH)}-Cox17和双铂加合物{Pt2(DACH)2}-Cox17。此外,三种铂与含铜蛋白CuICox172s-s的反应,都会引起铜从Cox17上的快速释放。可以推断,在细胞内与铂化合物的结合可能会抑制Cox17的生物学功能。同时我们发现,GSH对三种铂化合物与Cox172s-s的作用具有不同的影响。GSH的存在,对于顺铂、反铂、奥沙利铂和Cox172s-s的结合分别表现出促进、抑制、无影响三种不同的作用。这一现象与顺铂、奥沙利铂和反铂的抗肿瘤活性表现一致。更为重要的是,与GSH的反应之后,反铂和奥沙利铂被失活,顺铂不仅没有被失活,而且表现出更高的与Cox172s-s的反应活性。这些证据证明,GSH对铂类药物的生物学机制的影响可能是十分复杂多样的。第四章研究了亚砷酸钠与C2H2, C3H和C4型锌指的单结构域和多结构域蛋白质的作用,通过荧光方法检测了锌指蛋白与亚砷酸钠反应的亲和力和反应速率、电喷雾质谱检测了反应产物、圆二色光谱和核磁共振检测了亚砷酸钠对锌指结构变化的影响。得到了As(Ⅲ)与锌指蛋白结合的表观解离常数和准一级速率常数、结合产物组成以及、结构变化。结果表明,单锌指结构域蛋白与As(Ⅲ)的反应,在亲和力以及反应速率上都符合C4>C3H>>C2H2的趋势。C3H和C4型锌指比C2H2型对As(Ⅲ)的亲和力高两个数量级,显示出亚砷对锌指类型的选择性。对于多结构域锌指蛋白,多结构域的存在大大提高了C2H2型锌指蛋白对亚砷的亲和力,而对C3H和C4型影响很小,最终三种类型的多结构域蛋白表现出相似的亚砷反应活性。这表明配位位点的数目是影响蛋白与亚砷的亲和性强弱的最为关键的因素。第五章以NCp7-zf2作为模型蛋白研究了As(Ⅲ)、Zn2+对锌指蛋白的竞争关系,以及溶液环境对亚砷对锌指结构的破坏的影响;以Sp1-zf2作为模型蛋白,研究了含巯基生物小分子(GSH、Cys)对亚砷与双配位位点蛋白相互作用的影响。研究表明,亚砷和锌指蛋白的相互作用涉及到As(Ⅲ)、Zn2+对锌指蛋白的竞争结合,中性缓冲液中,Zn2+对锌指蛋白的亲和力远高于As(Ⅲ),所以亚砷不能破坏蛋白的锌指结构。但是,当受到细胞内因素(如pH值降低、GSH、 Cys、His等)的影响时,As(Ⅲ)、Zn2+的竞争会发生改变,As(Ⅲ)有可能取代锌指结构中的Zn2+。细胞因素的这种影响,主要是通过改变Zn2+与锌指蛋白的亲和力实现的,而对As(Ⅲ)与锌指蛋白的亲和力的影响较小。双巯基位点蛋白也是亚砷的重要靶点,在以Sp1-zf2蛋白为模型的研究上发现：GSH、Cys等含巯基分子可能对亚砷与双巯基配位位点蛋白的结合有重要作用。GSH、Cys的存在不仅提高了亚砷与Sp1-zf2结合的亲和力,也加快了二者的反应速率。质谱结果表明,GSH、Cys通过配位到As(Ⅲ)的第三个位点,促进了亚砷与双位点蛋白结合的稳定性。这些结果表明,砷的生理学作用机制可能受到细胞环境的重大影响。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
目录  10-13
第一章绪论  13-41
  1.1 引言  13-15
    1.1.1 癌症的治疗方法  13
    1.1.2 癌症的治疗药物  13-14
    1.1.3 铂类抗癌药物  14
    1.1.4 砷类抗癌药物  14-15
  1.2 铂类抗肿瘤药物的作用机制  15-16
  1.3 铂类药物的多靶点  16-19
    1.3.1 与谷胱甘肽的相互作用  16-18
    1.3.2 与蛋白质的相互作用  18
    1.3.3 与亚细胞结构的相互作用  18-19
  1.4 铂类药物与铜转运蛋白  19-21
  1.5 铜转运蛋白Cox17  21-24
    1.5.1 生物体内的Cox17分布  21-22
    1.5.2 Cox17的结构  22
    1.5.3 Cox17的功能  22-23
    1.5.4 Cox17与目标蛋白的作用  23-24
  1.6 砷的作用机制  24-26
    1.6.1 砷的致癌性  24-25
    1.6.2 砷用于癌症治疗  25-26
    1.6.3 小结  26
  1.7 锌指蛋白与砷  26-28
  参考文献  28-41
第二章顺铂与Cox17的相互作用  41-68
  2.1 引言  41-42
  2.2 实验材料与方法  42-56
    2.2.1 实验材料  42-43
    2.2.2 重组质粒构建  43-50
    2.2.3 蛋白表达与纯化  50-52
    2.2.4 其它生物化学方法  52-56
  2.3 结果与讨论  56-65
    2.3.1 Cox17蛋白的分离纯化和表征  56-59
    2.3.2 Cox17与顺铂的体外相互作用  59-63
    2.3.3 Cox17对顺铂的线粒体累积有贡献  63-65
  2.4 结论  65-66
  参考文献  66-68
第三章不同铂配合物与Cox17反应的比较  68-83
  3.1 引言  68-70
  3.2 实验材料与方法  70-72
    3.2.1 实验材料  70
    3.2.2 实验方法  70-72
  3.3 结果与讨论  72-80
    3.3.1 顺铂、反铂、奥沙利铂与Cox17铜位点巯基的相互作用  72-73
    3.3.2 铂化合物对Cox17铜结合的影响  73-74
    3.3.3 反应产物  74-75
    3.3.4 GSH调节铂化合物与Cox17的反应  75-80
  3.4 结论  80-81
  参考文献  81-83
第四章亚砷对不同类型锌指蛋白的反应选择性  83-100
  4.1 引言  83-84
  4.2 实验材料与方法  84-86
    4.2.1 实验材料  84
    4.2.2 实验方法  84-86
  4.3 结果与讨论  86-97
    4.3.1 锌指蛋白的纯度鉴定  86-88
    4.3.2 锌指蛋白的高分辨质谱鉴定  88-89
    4.3.3 亚砷酸钠与锌指蛋白的结合力  89-91
    4.3.4 亚砷酸钠与锌指蛋白结合的反应动力学  91-92
    4.3.5 亚砷与锌指蛋白的反应产物  92-94
    4.3.6 亚砷的结合对锌指蛋白结构的影响  94-97
  4.4 结论  97-98
  参考文献  98-100
第五章溶液环境对亚砷与锌指蛋白的反应的影响  100-118
  5.1 引言  100-101
  5.2 实验材料与方法  101-103
    5.2.1 实验材料  101
    5.2.2 实验方法  101-103
  5.3 结果与讨论  103-114
    5.3.1 亚砷与锌离子对NCp7-zf2锌指蛋白的竞争性结合  103-105
    5.3.2 低pH促进亚砷对锌指结构的破坏  105-108
    5.3.3 竞争配体促进亚砷与Zn-NCp7-zf2蛋白的相互作用  108-109
    5.3.4 溶液环境对亚砷与Zn-NCp7-zf2反应影响的分析  109-110
    5.3.5 巯基配体促进亚砷与双位点蛋白的结合  110-114
  5.4 结论  114-116
  参考文献  116-118
致谢  118-119
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  119

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