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蓝雪醌和拉帕醇的跨血脑屏障转运及对内皮细胞和胶质瘤细胞的影响

作　者: 郭晨阳
导　师: 薛明
学　校: 首都医科大学
专　业: 药理学
关键词: 蓝雪醌拉帕醇脑微血管内皮细胞氧糖剥夺乳酸脱氢酶细胞毒性 BBB共培养细胞模型转运体增殖抑制
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

天然来源的萘醌（naphthoquinone）是一类重要的生物活性成分，其在自然界中广泛存在。蓝雪醌和拉帕醇同属于α-(1,4-)型萘醌化合物，其独特的萘醌环决定了它们的物理化学特性和药理学效应。蓝雪醌和拉帕醇均具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤和血管保护作用等，拉帕醇还可作为抗疟药物使用。本文在蓝雪醌和拉帕醇对大鼠脑微血管内皮细胞（rat brainmicrovascular endothelial cell, BMEC）毒性评价的基础上，系统研究了两药对大鼠BMEC的保护作用，同时研究了蓝雪醌和拉帕醇在体外血脑屏障模型中的跨膜转运及其对相关转运体的作用，并进行了这两种药物对恶性胶质瘤C6细胞的增殖抑制实验。其结果为蓝雪醌和拉帕醇的进一步开发利用提供了坚实的实验依据。1.蓝雪醌和拉帕醇的跨血脑屏障转运原代培养大鼠BMEC和AS细胞。两种细胞在24孔板细胞培养插件上共培养，建立血脑屏障体外模型。共同培养10天后大鼠BMEC形成细胞间紧密连接。采用MTT法检测蓝雪醌和拉帕醇对大鼠BMEC的细胞毒性，同时确定维拉帕米、利福平、丙磺舒和新生霉素4种转运体抑制剂同时给药时的药物安全浓度。根据药物的溶解度与安全性浓度，选择合适的给药浓度，分别研究转运体抑制剂对蓝雪醌和拉帕醇跨血脑屏障转运的影响。药物样品使用HPLC定量方法检测，计算药物的表观渗透系数（Apparent permeability coefficient，Papp），求出药物的透过比率。结果表明，MRP2转运体抑制剂丙磺舒和BCRP转运体抑制剂新生霉素均能通过抑制转运体的主动外排作用，进而减少对蓝雪醌和拉帕醇的外排，提高二者对血脑屏障的透过率。2.蓝雪醌和拉帕醇对大鼠BMEC的保护作用取生长状态良好的第4代大鼠BMEC，采用氧糖剥夺法（oxygen andglucosedeprivation, OGD）模拟脑局部急性缺血，构建细胞低氧损伤模型。采用MTT比色法测定不同OGD处理时间的大鼠BMEC细胞存活率。根据低氧时间与组间差异选择合适的OGD时间点。选择合适的给药浓度进行乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出实验测定。取生长状态良好的第4代大鼠BMEC，接种于24孔板中，设置常氧对照组组和OGD组，分别置于普通培养箱和低氧箱中培养。分别取上清液及细胞裂解液检测LDH活性，计算细胞LDH漏出率。结果表明，与常氧对照组相比，OGD组LDH漏出率显著升高；蓝雪醌10μM时对大鼠BMEC仍有一定的细胞毒性，LDH漏出率高于常氧对照组，5μM时LDH漏出率与OGD对照组相比结果无显著差异，而1μM时能减轻OGD处理后造成的细胞损伤；拉帕醇在给药浓度为100μM时LDH漏出率与OGD对照组相比结果无显著差异，10μM及1μM时均能使细胞OGD损伤有所减轻。3.蓝雪醌和拉帕醇对恶性胶质瘤C6细胞的的增殖抑制作用取生长状态良好的第20代恶性胶质瘤C6细胞，接种于96孔板中，培养24h后给药，继续培养48h后，采用MTT比色法检测蓝雪醌及拉帕醇对C6细胞的细胞存活率，研究药物对细胞的增殖抑制作用。同时选择上市抗肿瘤药替莫唑胺作为阳性对照。结果表明，与阳性对照药比较，100μM蓝雪醌对C6细胞的增殖抑制作用与替莫唑胺500μM时相当，而拉帕醇在200μM对C6细胞的增殖抑制作用相对较弱。中、低浓度时拉帕醇对C6细胞均有增殖抑制作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
前言  10-13
第一章蓝雪醌和拉帕醇的跨血脑屏障转运  13-38
  1. 材料  13-15
    1.1. 药品及试剂  13-14
    1.2. 仪器  14-15
    1.3. 动物  15
  2. 方法  15-24
    2.1. 原代大鼠 BMEC 的分离培养  15-16
    2.2. 原代星形胶质细胞（AS）的分离培养  16-18
    2.3. 大鼠 BMEC 与 AS 共培养建立体外 BBB 模型  18-20
    2.4. 蓝雪醌和拉帕醇对大鼠 BMEC 细胞存活率的影响  20-21
    2.5. 转运体抑制剂同时给药对大鼠 BMEC 存活率的影响  21
    2.6 ．蓝雪醌和拉帕醇的跨血脑屏障转运与数据分析  21-24
  3. 结果  24-34
  4.讨论  34-38
第二章蓝雪醌和拉帕醇对大鼠 BMEC 的保护作用  38-49
  1. 材料  38-39
    1.1. 药品及试剂  38
    1.2. 仪器  38-39
  2. 方法  39-42
    2.1. 建立大鼠 BMEC 细胞低氧损伤模型  39-40
    2.2. 蓝雪醌和拉帕醇对大鼠 BMEC 低氧损伤时 LDH 漏出率的影响  40-42
  3.结果  42-46
  4. 讨论  46-49
第三章蓝雪醌和拉帕醇对胶质瘤细胞的抑制作用  49-56
  1. 材料  49-50
    1.1. 药品及试剂  49-50
    1.2. 仪器  50
  2. 方法  50-52
    2.1 ．胶质瘤 C6 细胞的培养、传代  50-51
    2.2. 蓝雪醌和拉帕醇对胶质瘤 C6 细胞的增殖抑制作用  51-52
  3. 结果  52-54
  4. 讨论  54-56
参考文献  56-64
综述  64-78
  参考文献  71-78
附录  78-79
攻读学位期间发表论文情况  79-80
致谢  80-81
个人简历  81

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