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MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)乳腺癌细胞株的建立及对细胞增殖影响的初步探讨
作 者: 王英英
导 师: 史健
学 校: 河北医科大学
专 业: 肿瘤学
关键词: 乳腺癌细胞 酪氨酸激酶 Syk(S) 转染 凋亡 周期
分类号: R737.9
类 型: 硕士论文
年 份: 2014年
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内容摘要
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一类疾病,恶性肿瘤的发生、发展是多步骤、多因素参与的过程,其本质体现在基因水平的变化,如原癌基因的异常活化和(或)抑癌基因失活和缺失及其引起相关蛋白产物的变化,相应的引起了细胞出现持续性分化,自主性增殖,凋亡受限等最终导致肿瘤的发生及侵袭、转移的出现。而研究发现超过50%的原癌基因及抑癌基因产物均有蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)活性,近些年研究较多的脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)是Syk基因的蛋白产物,属一种非受体型蛋白酪氨酸激酶,其转录过程选择性拼接可出现二种异构体,即全长型Syk(L)和缩短型Syk(S),二者在DEL功能域上相差了23个氨基酸,故其在功能上也存在差异,国内外研究发现Syk(L)在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌等多种腺上皮来源的肿瘤生长和转移起抑制作用,对于其作用机制及作为治疗靶点的体外研究也也越来越清晰。但对于缩短型Syk(S),有学者认为其可能发挥癌基因功能,目前对其研究较少,更是缺乏Syk(S)在肿瘤中作用机制研究。目的:本实验拟通过质粒转染建立稳定表达Syk(S)的乳腺癌细胞株,并初步探讨Syk(S)基因对乳腺癌细胞增殖功能的影响。方法:1Syk(S)基因重组质粒的扩增及质粒稳定转染Syk阴性表达乳腺癌MDA-MB-231细胞株的建立1.1质粒扩增及细胞稳定转染:将携带Syk(S)基因的质粒转化至DH5α大肠杆菌中进行扩增,并使用脂质体法将携带Syk(S)基因的质粒转染至Syk阴性表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞系,经G418筛选获得基因稳定表达的乳腺癌细胞株(MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S))。并以Syk基因阳性表达的乳腺癌细胞MCF7作为阳性对照,以转染空载体的乳腺癌细胞(MDA-MB-231pcDNA3.1)及未转染的乳腺癌细胞MDA-MB-231作为阴性对照。1.2稳定转染细胞株的验证:实验分组:对照组:人乳腺癌MDA-MB-231细胞和转染空载体MDA-MB-231pcDNA3.1细胞;实验组:MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞。采用免疫组化验证Syk(S)蛋白的表达;并对转染细胞株进行连续传代,传至第四代,同时对每代细胞进行蛋白提取,冻存。最后用Western-blot方法检测各代稳定转染的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)中Syk(S)蛋白的表达。2MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)的增殖及凋亡的变化2.1实验分组:对照组:人乳腺癌MDA-MB-231细胞和转染空载MDA-MB-231pcDNA3.1细胞;实验组:MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞。2.2应用流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231pcDNA3.1细胞、MDA-MB-231pcDNA3.1-Syk(S)细胞周期及凋亡情况,比较稳定转染后MDA-MB-231细胞周期与凋亡的变化,探讨Syk(S)对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。结果:1成功将Syk(S)质粒扩增并转染至乳腺癌细胞,形成MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞,将MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞经抗生素G418(400μg/mL)筛选,扩增,挑克隆,得到20株Syk(S)基因稳定转染的克隆。细胞形态无明显改变。2免疫组化检测结果显示:应用抗Syk多克隆抗体结果提示:稳定转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)显示胞浆棕黄色颗粒,MDA-MB-231pcDNA3.1及MDA-MB-231细胞胞浆、胞核均未见显色;阳性对照乳腺癌细胞MCF7胞浆、胞核均可见棕黄色颗粒。应用抗Syk(L)单克隆抗体结果显示: MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)及MDA-MB-231pcDNA3.1细胞胞浆、胞核均未见染色,与预期结果一致,证明转染成功。3Western-blot检测结果显示: Ⅰ-Ⅳ代转染细胞株MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)中Syk(S)蛋白表达量稳定且基本一致,而对照组MDA-MB-231pcDNA3.1细胞不表达Syk(S)蛋白,证明该稳定转染细胞株构建成功。4流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:实验组:MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞凋亡率(A)0.35士0.32%小于对照组:MDA-MB-231pcDNA3.1细胞(B)2.54士1.10%和MDA-MB-231细胞(C)3.32士1.63%细胞凋亡率,差异有统计学意义(P<0.05)。5流式细胞仪检测细胞周期结果显示:实验组:MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞中,29.77%的细胞处在G0/G1期,43.72%的细胞处在S期,而在对照组:MDA-MB-231pcDNA3.1细胞中,39.73%的细胞处在G0/G1期,仅有25.53%处在S期和MDA-MB-231细胞中38.93%的细胞处在G0/G1期,21.23%处在S期,说明转染Syk(S)后细胞G0/G1期比例显著减低,S期比例明显升高,差别有统计学意义(P<0.05);三组间G2/M期比例无显著性差异(P>0.05)。结论:1成功建立了稳定表达Syk(S)蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞株。2Syk(S)表达通过促进G0/G1期向S期过渡使细胞增殖增加,同时抑制细胞凋亡从而促进乳腺癌细胞生长而发挥其癌基因功能。
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全文目录
摘要 4-7 ABSTRACT 7-10 前言 10-11 材料与方法 11-19 结果 19-21 附图 21-25 附表 25-27 讨论 27-30 结论 30 参考文献 30-34 综述 Syk 与 Her-2 在胃癌相关性研究新进展 34-42 参考文献 39-42 致谢 42-43 个人简历 43
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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