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MTA1在小细胞肺癌中功能的研究

作　者: 薛洪省
导　师: 赵志龙
学　校: 大连大学
专　业: 外科学
关键词: 肿瘤转移相关蛋白1 肿瘤干细胞小细胞肺癌 MTA1 转基因构建鉴定
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：研究MTA1在小细胞肺癌中的生物学作用。方法：采用免疫组化、Western-blot以及PCR技术，利用小细胞肺癌-正常肺组织芯片、小细胞肺癌细胞株H446、MTA1转基因小鼠，测定其中MTA1表达。通过小细胞肺癌细胞株H446转染MTA1-siRNA观察其在生长、粘附、细胞凋亡、细胞周期、侵袭转移等肿瘤恶性生物学行为方面的变化。结果：小细胞肺癌细胞系中MTA1高水平表达，使用MTA1小分子干扰RNA下调其mRNA及蛋白表达，通过PCR和western blot验证干扰。1、下调H446中MTA1表达，显著降低其增殖能力；2、下调H446中MTA1表达，显著降低其粘附和侵袭能力；3、下调H446中MTA1表达，显著降低其划痕愈合能力；4、MTA1介导小细胞肺癌细胞生存信号，下调MTA1后细胞凋亡显著增加；5、MTA1在人小细胞肺癌组织芯片以及MTA1转基因小鼠肺组织中高表达，下调MTA1后肿瘤干细胞标志基因表达沉默。结论：MTA1在小细胞肺癌中作为关键调控因子，发挥着重要生物学作用。MTA1涉及肿瘤干细胞调控，并且在肿瘤的增殖、侵袭、转移、凋亡方面具有显著影响。目的：将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中，构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法：通过RT-PCR方法克隆人的MTA1基因，将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体，回收片段后利用显微注射技术将连接目的基因片段注入到受精卵的雄原核中，使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠，再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身表达情况。结果：成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中，10只ICR小鼠均怀孕，移植成功率为100%，共生出子代鼠80只，经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因，整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠，再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高，肾、骨骼肌表达无差异。结论：成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠，为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。

全文目录

第一部分下调小细胞肺癌中 MTA1 表达对肿瘤恶性生物学行为抑制作用的研究  7-32
  摘要  7-8
  Abstract  8-9
  引言  9-10
  1 材料与方法  10-20
    1.1 细胞系及培养条件  10
    1.2 实验仪器和试剂  10-16
      1.2.1 主要实验仪器  10
      1.2.2 主要实验试剂及材料  10-16
    1.3 实验方法  16-19
      1.3.1 细胞转染  16
      1.3.2 聚合酶链反应（PCR）  16
      1.3.3 免疫印迹分析（Western blot）  16-17
      1.3.4 细胞增殖实验（MTS）  17
      1.3.5 平板克隆实验  17
      1.3.6 细胞粘附实验  17-18
      1.3.7 细胞侵袭实验  18
      1.3.8 划痕实验  18
      1.3.9 流式细胞仪检测细胞周期  18
      1.3.10 流式细胞仪检测细胞凋亡  18
      1.3.11 免疫组化  18-19
    1.4 数据处理  19-20
  2 结果  20-27
    2.1 小细胞肺癌 H446 中下调 MTA1 表达，显著降低其增殖能力  20
    2.2 小细胞肺癌 H446 中下调 MTA1 表达，显著降低其粘附和侵袭能力  20-21
    2.3 小细胞肺癌 H446 中下调 MTA1 表达，显著降低其划痕愈合能力  21-22
    2.4 MTA1 介导小细胞肺癌细胞生存信号，下调 MTA1 后细胞凋亡显著增加  22-23
    2.5 MTA1 在人小细胞肺癌组织芯片以及 MTA1 转基因小鼠肺组织中高表达，下调MTA1 后肿瘤干细胞标志基因表达沉默  23-27
  3 讨论  27-29
  结论（一）  29-30
  参考文献  30-32
第二部分 MTA1 转基因小鼠的构建及鉴定  32-45
  摘要  32-33
  Abstract  33-34
  引言  34-35
  1 材料与方法  35-37
    1.1 实验动物  35
    1.2 目的基因的构建  35
    1.3 转基因注射片段的制备  35
    1.4 转基因小鼠的制备  35
    1.5 MTA1 转基因小鼠的整合检测  35-36
    1.6 MTA1 转基因小鼠的表达检测  36-37
      1.6.1 蛋白印迹分析（Westernblot）  36
      1.6.2 免疫组织化学检测  36-37
  2 结果  37-41
    2.1 MTA1 转基因的构建  37
    2.2 转基因小鼠的制备  37
    2.3 MTA1 转基因小鼠的整合鉴定  37-38
    2.4 MTA1 转基因小鼠的表达分析  38-41
      2.4.1 MTA1 蛋白的组织器官的表达分析  38-39
      2.4.2 MTA1 蛋白的组织器官的免疫组化分析  39-41
  3 讨论  41-42
  结论（二）  42-43
  参考文献  43-45
综述  45-52
  参考文献  48-52
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  52-53
致谢  53

MTA1在小细胞肺癌中功能的研究

内容摘要

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