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ALS相关突变蛋白SOD1-G93A介导PC12细胞损伤

作　者: 陈相
导　师: 于秀军
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 肌萎缩侧索硬化超氧化物歧化酶氧化应激脂质过氧化丙二醛细胞凋亡线粒体血红素加氧酶
分类号: R744
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：肌萎缩侧索硬化是一种神经变性疾病，其特征是选择性的侵犯脊髓前角细胞、脑干后组运动神经元、皮质锥体细胞及锥体束，导致上、下运动神经元变性死亡，患者出现严重的肌无力，多数终因呼吸肌受累而死于呼吸衰竭。全世界范围内对ALS的研究目前主要集中于SOD1-G93A的转基因小鼠模型，所以将研究扩展到其他模型以进一步探讨SOD1-G93A在ALS致病中的作用就具有重要意义。本实验采用突变的人SOD1-G93A质粒转染PC12细胞，从氧化应激、线粒体异常改变以及细胞凋亡的角度探讨SOD1-G93A对PC12细胞的影响极其可能的作用机制。为将来进一步的研究打下基础。方法：1实验分组实验设置空白对照组、转染空质粒对照组以及转染人SOD1-G93A组。2细胞培养及细胞转染复苏冻存于液氮罐中的高分化PC12细胞，以含有灭活的胎牛血清及青链霉素的10%高糖DMEM作为培养液，在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞。细胞复苏传代3次以后，待突起明显、形态规则、融合密度为80%时，取对数生长期分别转染人SOD1-G93A质粒、空质粒至PC12细胞。转染过程严格遵守LipofectamineTM2000试剂说明书的操作规范。转染48h后收集细胞样本用于实验研究。3丙二醛检测收集并裂解细胞，使用硫代巴比妥酸（TBARS）法测定细胞MDA水平。严格按照试剂盒说明书进行实验操作，在532nm波长处读取样本吸光度。4蛋白质免疫印迹提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度。以30ug蛋白为上样量，进行钠十二烷基的硫酸盐(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳，然后将凝胶上的蛋白转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜与一抗在4℃摇床下孵育过夜。次日再与结合有荧光染料的二抗孵育。Odyssey红外图像扫描系统对PVDF膜进行扫描以确定目的蛋白的表达水平。5细胞凋亡率测定消化贴壁的PC12细胞，制成单细胞悬液，离心去上清以后加入PBS重悬细胞并计数，取1-5x105个细胞离心去上清，加入500ul1x Bindingbuffer重悬细胞，加入10ul PI，室温避光孵育5min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。6活细胞线粒体观测用移液器沿侧壁小心去除激光共聚焦显微镜专用玻底培养皿中的细胞培养液，37℃温浴的D-Hank’s洗两遍，加入1ml不含酚红和抗生素的DMEM培养基，按线粒体染色剂（mitored tracker）/培养基为1:1000的比例，加入线粒体染色剂，轻轻混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育45分钟。15分钟后以1:500的比例加入核染色剂Hoechst，培养箱中孵育30分钟。孵育完毕后去除培养液，D-Hank’s洗一遍，加入不含酚红的DMEM培养基，拿出培养室进行confocal观测。结果：1成功的培养PC12细胞并完成质粒转染倒置荧光显微镜显微镜下观察，我们培养的PC12细胞贴壁良好形态规则，突起明显；SOD1-G93A质粒转染成功，蛋白质免疫印迹法在对应位置检测到含有EGFP标签的外源性SOD1，流式细胞仪测定转染效率为20.1%。2丙二醛水平测定MDA含量代表了细胞脂质过氧化水平，可间接反映氧化应激水平。转染48h后提取细胞蛋白测定MDA，结果显示SOD1-G93A组MDA值明显高于对照组（p<0.01），有统计学意义。这表明转染人SOD1-G93A引发了PC12细胞脂质过氧化损伤。3血红素氧合酶1表达水平测定HO-1是体内重要的抗氧化酶，在多种刺激条件下可被诱导，比如氧化应激。在PC12细胞转染人SOD1-G93A，48h后提取细胞蛋白用于蛋白质免疫印迹，观测血红素氧合酶1的变化。结果显示HO-1在转染人SOD1-G93A组相比于对照组明显升高（p<0.01)，有统计学意义。4细胞凋亡率凋亡中、晚期细胞，细胞膜的完整性受到比较严重的破坏，溴化乙锭可进入细胞内将细胞核红染，以此可较为客观地判定细胞凋亡率。转染人SOD1-G93A48h后收集细胞用于凋亡率检测。结果显示转染人SOD1-G93A组细胞凋亡率高达40.9%，正常对照组仅为9.7%。5线粒体形态改变转染48h后hoechst标记细胞核，mitored标记线粒体，直接观测激光共聚焦显微镜专用玻底培养皿中的活细胞。过表达SOD1-G93A组细胞出现较为明显的线粒体碎片，且偶见巨型线粒体聚集体。结论：SOD1-G93A在PC12细胞可引起细胞功能障碍。主要表现为：1导致细胞氧化应激增强，继而引起脂质过氧化损害。2上调了HO-1的表达水平3引起线粒体异常改变4细胞凋亡率异常升高

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11-13
材料与方法  13-23
结果  23-25
附图  25-30
讨论  30-31
结论  31
参考文献  31-35
综述线粒体与神经系统变性疾病  35-47
  参考文献  40-47
致谢  47-49
个人简历  49

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