学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

RNAi沉默Notch1对人骨肉瘤MG63细胞增殖及凋亡的影响及其机制研究

作　者: 吴德明
导　师: 戴闽
学　校:
专　业: 外科学
关键词: 骨肉瘤 RNA干扰 Notch1基因 凋亡
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 14次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的：本研究拟通过构建靶向Notch1基因的shRNA重组质粒干扰阻断MG63细胞Notch1信号通路后观察其对细胞增殖及凋亡的影响及其检测Bcl-2及Bax蛋白表达变化。方法：（1）设计3对针对Notch1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体，脂质体介导转染转基因细胞MG63，qRT-PCR及Western Blotting分别检测瞬时转染shRNA前后Notch1蛋白及mRNA的表达，筛选出干扰效率最强的shRNA；（2）将筛选出的干扰效率最强的shRNA稳定转染至MG63细胞，利用MTT增殖实验、Annexin V法染色和流式细胞术流式检测MG63细胞增殖及细胞凋亡情况的变化；（3）阻断Notch1信号通路后，利用Western Blotting方法检测MG63细胞中Bcl-2及Bax蛋白变化。结果：（1）成功构建含Notch1shRNA片段的重组质粒，分别命名为shRNAa、b、c，瞬时转染MG63细胞后， Notch1基因的mRNA及蛋白表达水平均下调。其中，shRNAa重组质粒的沉默效应最强，其RNA水平的抑制率为79.66%（p<0.05）。（2）运用shRNAa稳定转染MG63细胞干扰阻断Notch1信号通路后，MTT增殖实验、Annexin V法染色和流式细胞学检测细胞增殖与凋亡状况，与对照组相比，其细胞增殖速度减慢(p<0.05)，细胞凋亡增加（p<0.05）。（3）运用shRNAa稳定转染MG63细胞干扰阻断Notch1信号通路后，Western Blotting检测发现MG63-shRNAa细胞的Bcl-2蛋白表达下降，而Bax蛋白表达上调。结论：（1）靶向Notch1基因的shRNA的重组质粒构建成功，含靶向Notch1基因的shRNA的重组质粒能有效阻断Notch1信号通路；（2）RNAi沉默Notch1基因能明显抑制人MG63细胞增殖，促进细胞凋亡，其作用机制可能与调控Bcl-2及Bax蛋白表达有关。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-9
中英文缩略词表  9-10
第1章 前言  10-12
第2章 材料和方法  12-25
  2.1 细胞株  12
  2.2 主要试剂  12-17
    2.2.1 购买试剂  12-13
    2.2.2 试验方法  13-16
    2.2.3 主要仪器设备  16-17
  2.3 细胞的传代和培养  17
  2.4 靶向 Notch1 基因 shRNA 重组质粒的构建  17-18
  2.5 瞬时转染靶向 Notch1 的 shRNA 重组质粒  18
  2.6 MG63 细胞对潮霉素 B 的敏感性测试  18-19
  2.7 稳定转染靶向 Notch1 的 shRNA 重组质粒  19
  2.8 实时定量 PCR(qRT-PCR)  19-20
  2.9 Western blotting  20-25
    2.9.1 细胞总蛋白的提取  20-21
    2.9.2 蛋白浓度测定  21
    2.9.3 蛋白变性  21
    2.9.4 制胶  21
    2.9.5 SDS-PAGE 电泳  21-22
    2.9.6 转膜  22
    2.9.7 免疫杂交  22-23
    2.9.8 化学发光，显影、定影  23
    2.9.9 MTT 法检测 MG63 细胞增殖情况  23-24
    2.9.10 细胞周期的检测  24
    2.9.11 细胞凋亡的检测  24
    2.9.12 统计学分析  24-25
第3章 结果  25-32
  3.1 重组质粒 shRNA 的鉴定  25-26
  3.2 shRNA 重组质粒对 Notch1 基因表达的抑制作用  26-27
    3.2.1 qRT-PCR 检测 Notch1 mRNA 的表达  26-27
    3.2.2 Western blotting 检测 Notch1 蛋白的表达  27
  3.3 Notch1 信号通路阻断后对 MG63 细胞生物学行为的影响  27-31
    3.3.1 筛选 Notch1 稳定低表达的细胞株  27
    3.3.2 MTT 检测阻断 Notch1 信号通路对 MG63 细胞增殖的影响  27-28
    3.3.3 流式细胞学检测阻断 Notch1 信号通路对 MG63 细胞周期的影响  28-29
    3.3.4 流式细胞学检测阻断 Notch1 信号通路对 MG63 细胞凋亡的影响  29-31
  3.4 Notch1 信号通路阻断后 MG63 细胞 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达的变化  31-32
第4章 讨论  32-35
第5章 结论  35-36
参考文献  36-38
攻读学位期间的研究成果  38-39
综述  39-45
  参考文献  44-45

相似论文

  1. 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
  2. 醋酸铅对鲤鱼卵巢上皮细胞毒性的研究,X174
  3. 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产,S435.32
  4. 几种新型杀虫剂对马铃薯甲虫的毒力及两类靶标的分子克隆,S435.32
  5. β-catenin在猪卵巢组织中的表达以及对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响,S828
  6. 沉默BMPR-IB基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡及BMP通路相关基因表达的影响,S828
  7. 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
  8. 蜂毒素对人肝癌HepG-2细胞株裸鼠移植瘤生长的抑制作用及部分机制研究,R735.7
  9. MCFP对肝癌细胞生物行为学影响初步研究,R735.7
  10. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导仓鼠肾细胞凋亡信号转导机制的研究,S856.9
  11. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导人结肠癌细胞凋亡线粒体信号转导机制的研究,R735.35
  12. 灰飞虱功能基因的克隆及其RNAi致死效应,S435.112.3
  13. 磷脂酶C和D在木聚糖酶诱导的水稻悬浮细胞抗病反应中的作用,S511
  14. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,S828
  15. 大承气汤对多器官功能障碍综合征大鼠小肠平滑肌细胞Bcl-2和Bax表达的影响,R285.5
  16. 重组hIL-10抗家兔皮肤移植排斥反应及其对IL-2、IFN-γ、GCs、T细胞凋亡的影响,R392
  17. 氯通道阻断剂对一氧化氮诱导培养大鼠海马神经元凋亡的影响,R363
  18. As2O3对体外培养成骨细胞增殖与凋亡和BMP-2基因表达的影响,R363
  19. E1A激活基因阻遏子蛋白对病理性血管内皮凋亡的调控作用及机制研究,R363
  20. 外源性NO对旋毛虫肌幼虫杀伤作用及其机制研究,R532.14
  21. 液体复苏时间和维生素C对烧伤后大鼠受损部位皮肤及毛囊上皮细胞凋亡的影响,R644

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 骨骼肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com